遺伝子組み換え

分子生物学と遺伝学において、形質転換とは、細胞膜を通して周囲の外因性遺伝物質を直接取り込み、組み込むことによって生じる細胞の遺伝子変化のことである。形質転換が起こるためには、受容細菌がコンピテンス状態にある必要があり、これは自然界では飢餓や細胞密度などの環境条件に対する時間制限のある反応として起こる可能性があり、実験室で誘発されることもある。^[1]

形質転換は、外来遺伝物質が細菌から別の細菌に渡される水平遺伝子伝達につながる3つのプロセスのうちの1つであり、他の2つは接合（直接接触する2つの細菌細​​胞間での遺伝物質の移動）と形質導入（バクテリオファージウイルスによる外来DNAの宿主細菌への注入）である。^[1]形質転換では、遺伝物質は介在培地を通過し、その取り込みは完全に受容細菌に依存する。^[1]

2014年時点で、形質転換能力を持つ細菌は約80種知られており、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌がほぼ均等に分かれている。報告のいくつかは単一の論文によって裏付けられているため、この数は過大評価されている可能性がある。^[1]

「形質転換」は、動物細胞や植物細胞を含む非細菌細胞への新しい遺伝物質の挿入を説明するためにも使用されることがあります。しかし、「形質転換」は動物細胞との関係で特別な意味を持ち、癌状態への進行を示すため、このプロセスは通常「トランスフェクション」と呼ばれます。^[2]

細菌の形質転換は、1928年にイギリスの細菌学者フレデリック・グリフィスによって初めて実証されました。^[3]グリフィスは、加熱殺菌した細菌の注射がマウスの肺炎ワクチン接種に使用できるかどうかを調べることに興味を持っていました。しかし、彼は、非毒性の肺炎球菌株が、加熱殺菌した毒性株にさらされると毒性になることを発見しました。グリフィスは、加熱殺菌株の何らかの「形質転換原理」が、無害な株を毒性にする原因であると仮説を立てました。1944年に、この「形質転換原理」は、オスワルド・エイブリー、コリン・マクロード、およびマクリン・マッカーティによって遺伝的であると特定されました。彼らは、 S.肺炎球菌の毒性株からDNAを単離し、このDNAだけを使用して無害な株を毒性にすることができました。彼らは、細菌によるこのDNAの取り込みと組み込みを「形質転換」と呼んだ（エイブリー・マクラウド・マッカーティ実験を参照）^[4]。エイブリーらの実験結果は、当初科学界から懐疑的に受け止められたが、遺伝子マーカーの開発とジョシュア・レーダーバーグによる遺伝子伝達の他の方法（1947年の接合と1953年の形質導入）の発見によって、エイブリーの実験は受け入れられた。^[5]

実験室でよく使われる大腸菌は、もともと形質転換に耐性があると考えられていました。しかし、1970年にモートン・マンデルと比嘉明子は、塩化カルシウム溶液で処理すると、大腸菌がヘルパーファージを使用せずにバクテリオファージλからDNAを取り込むように誘導できることを示しました。[ 6 ] 2年^後の1972年にスタンレー・ノーマン・コーエン、アニー・チャン、レスリー・スーは、CaCl
₂この処理はプラスミドDNAの形質転換にも効果的である。^[7]マンデルと比嘉による形質転換法は後にダグラス・ハナハンによって改良された。^[8]大腸菌における人工的に誘導されたコンピテンスの発見は、細菌の形質転換のための効率的で便利な手順を生み出し、バイオテクノロジーと研究におけるより簡単な分子クローニング方法を可能にし、現在では日常的に使用されている実験室手順となっている。

1980年代後半には、エレクトロポレーションを用いた形質転換が開発され、in vitro形質転換の効率が向上し、形質転換できる細菌株の数が増えました。 ^[9]動物細胞と植物細胞の形質転換も研究され、1982年にはラットの成長ホルモンの遺伝子をマウスの胚に注入することで、最初のトランスジェニックマウスが作成されました。 ^[10] 1897年には、植物の腫瘍を引き起こす細菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが発見され、1970年代初頭には、腫瘍誘発因子はTiプラスミドと呼ばれるDNAプラスミドであることがわかりました。^[11]腫瘍を引き起こすプラスミドの遺伝子を除去し、新しい遺伝子を追加することで、研究者は植物をA.ツメファシエンスに感染させ、細菌が選択したDNAを植物のゲノムに挿入することができました。^{[12]すべての植物細胞が}A. tumefaciensに感染するわけではないので、電気穿孔法やマイクロインジェクション法などの他の方法が開発されました。^[13]粒子衝撃法は、1980年代にジョン・サンフォードが遺伝子銃（バイオリスティック粒子送達システム）を発明したことで可能になりました。 ^{[14] [15] [16]}

形質転換は、自然界の細菌間で起こる水平遺伝子伝達の3つの形態のうちの1つであり、形質をコードするDNAが1つの細菌から別の細菌に渡され、相同組換えによって受容体ゲノムに組み込まれます。他の2つは、バクテリオファージによって行われる形質導入と、細菌間の直接接触によって遺伝子が渡される接合です。 ^[1]形質転換では、遺伝物質が介在する培地を通過し、その取り込みは受容体細菌に完全に依存します。^[1]

能力とは、環境から外来DNAを取り込むことができる一時的な状態を指し、実験室で誘発されることもあります。^[1]

これは共通の原核生物の祖先から受け継がれた古代のプロセスであり、DNA損傷、特にストレスの多い状況で受けた損傷の組み換え修復を促進するための有益な適応であると思われます。自然な遺伝子形質転換は、遺伝的多様性も生み出すDNA損傷の修復のための適応であると思われます。^{[1] [17]}

形質転換は、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ、髄膜炎菌、淋菌、インフルエンザ菌、コレラ菌などの医学的に重要なグラム陰性細菌種で研究されてきました。^[18]また、シュードモナス・スタッツェリ、アシネトバクター・ベイリー などの土壌中に生息するグラム陰性菌種や、ラルストニア・ソラナセラムやキシレラ・ファスティディオサなどのグラム陰性植物病原菌でも研究されてきました。^[18]グラム陽性細菌の形質転換は、肺炎球菌、ミュータンス菌、黄色ブドウ球菌、サンギニス菌などの医学的に重要な種や、グラム陽性土壌細菌の枯草菌で研究されてきた。^[17]また、いくつかの異なる綱に分布する少なくとも30種の緑膿​​菌でも報告されている。^[19]形質転換に関して最もよく研​​究されている緑膿菌は、医学的に重要なヒト病原体である淋菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリである。^[17]

「形質転換」は、動物細胞や植物細胞を含む非細菌細胞への新しい遺伝物質の挿入を説明するためにも使用されることがあります。しかし、「形質転換」は動物細胞との関係で特別な意味を持ち、癌状態への進行を示すため、このプロセスは通常「トランスフェクション」と呼ばれます。^[2]

天然にコンピテントな細菌は、細胞膜を越えてDNAを運ぶためのタンパク質機構を提供する遺伝子セットを持っています。外来DNAを細胞内に輸送するには、IV型ピリとII型分泌システムの組み立てに関与するタンパク質、および細胞質膜のDNAトランスロカーゼ複合体が必要になる可能性があります。^[20]

グラム陽性菌とグラム陰性菌の細胞膜構造の違いにより、これらの細胞における DNA 取り込みのメカニズムには若干の違いがあるが、それらのほとんどは関連タンパク質が関与する共通の特徴を共有している。DNA はまず DNA 受容体上のコンピテント細胞表面に結合し、DNA トランスロカーゼを介して細胞質膜を通過する。 ^[21]通過できるのは一本鎖 DNA のみで、もう一方の鎖はその過程でヌクレアーゼによって分解される。その後、転座した一本鎖 DNA はRecA依存プロセスによって細菌染色体に組み込まれる。グラム陰性細胞では、余分な膜が存在するため、DNA は外膜上のセクレチンによって形成されるチャネルの存在を必要とする。ピリンはコンピテンスに必要かもしれないが、その役割は不明である。^[22] DNA の取り込みは一般に配列特異的ではないが、一部の種では特定の DNA 取り込み配列の存在が効率的な DNA 取り込みを促進する可能性がある。^[23]

自然形質転換は、DNA転移のための細菌の適応であり、多数の細菌遺伝子の発現に依存しており、その遺伝子産物がこの過程を担っていると考えられる。^{[20] [19]}一般に、形質転換は複雑でエネルギーを必要とする発達過程である。細菌が外来DNAを結合し、取り込み、染色体に組み換えるためには、細菌はコンピテントになる、つまり特別な生理学的状態に入る必要がある。枯草菌におけるコンピテント発達には約40個の遺伝子の発現が必要である。^[24]宿主染色体に組み込まれるDNAは通常（まれな例外はあるが）、同じ種の別の細菌に由来し、したがって常在染色体と相同である。

B. subtilisでは、転移したDNAの長さは1271 kb（100万塩基以上）以上です。^[25]転移した長さはおそらく二本鎖DNAであり、染色体全体の長さ4215 kbの3分の1以上になることがよくあります。^[26]受容細胞の約7〜9％が染色体全体を占めているようです。^[27]

自然な形質転換能力は多くの原核生物で発生しているようで、これまでに67種の原核生物種（7つの異なる門）がこの過程を経ることが知られています。^[19]

形質転換の能力は、通常、細菌増殖の定常期に関連する条件である、高い細胞密度および/または栄養制限によって誘導される。インフルエンザ菌における形質転換は、細菌増殖が定常期に近づく指数関数的増殖の終わりに最も効率的に起こる。 ^[28]ミュータンス菌や他の多くの連鎖球菌における形質転換は、高い細胞密度で起こり、バイオフィルム形成と関連している。^[29]枯草菌における能力は、特にアミノ酸制限条件下で、対数増殖の終わりに向かって誘導される。^[30]同様に、あまり研究されていない放線菌門の代表であるミクロコッカス・ルテウスでは、能力は指数関数的増殖期の中期から後期に発達し、アミノ酸飢餓によって引き起こされる。^{[31] [32]}

特定のバクテリオファージは、宿主とプラスミドDNAをそのまま放出することで形質転換に寄与すると考えられている。^[33]

コンピテンスは、DNA損傷条件によって特異的に誘導されます。たとえば、肺炎球菌では、DNA損傷剤であるマイトマイシンC（DNA架橋剤）とフルオロキノロン（二本鎖切断を引き起こすトポイソメラーゼ阻害剤）によって形質転換が誘導されます。^[34] B. subtilis では、DNA損傷剤である紫外線によって形質転換が増加します。^[35] Helicobacter pyloriでは、DNAジャイレースと相互作用して二本鎖切断を誘導するシプロフロキサシンがコンピテンス遺伝子の発現を誘導し、形質転換の頻度を高めます。^[36] Charpentierら^[37]は、 Legionella pneumophilaを使用して64の毒性分子をテストし、どれがコンピテンスを誘導するかを調べました。これらのうち、6つだけ（すべてDNA損傷剤）が強い誘導を引き起こしました。これらのDNA損傷剤は、マイトマイシンC（DNA鎖間の架橋を引き起こす）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ナリジクス酸（二重鎖切断を引き起こすDNAジャイレースの阻害剤^[38]）、ビシクロマイシン（一本鎖および二重鎖切断を引き起こす^[39]）、およびヒドロキシウレア（DNA塩基の酸化を誘導する^[40]）であった。紫外線もL. pneumophilaのコンピテンスを誘導した。Charpentierら^[37]は、形質転換のコンピテンスはおそらくDNA損傷応答として進化したと示唆した。

対数増殖期の細菌は、細胞内に存在するゲノムコピー数に関して定常期の細菌とは異なり、これは重要なDNA 修復プロセスを実行する能力に影響を及ぼします。対数増殖期には、細胞分裂が染色体複製と正確に一致しないため、細菌細胞内に染色体の特定領域の 2 つ以上のコピーが存在する可能性があります。相同組換え修復 (HRR) プロセスは、二重鎖切断などの二重鎖損傷の修復に特に効果的な重要な DNA 修復プロセスです。このプロセスは、損傷した染色体に加えて、2 番目の相同染色体に依存します。対数増殖期には、1 つの染色体の DNA 損傷は、他の相同染色体の配列情報を使用して HRR によって修復される場合があります。ただし、細胞が定常期に近づくと、通常は染色体のコピーが 1 つだけになり、HRR には形質転換による細胞外からの相同テンプレートの入力が必要になります。^[41]

形質転換の適応機能が DNA 損傷の修復であるかどうかをテストするために、損傷因子として紫外線を照射したB. subtilisを使用した一連の実験が行われた (Michod ら^[42]および Bernstein ら^[41]によるレビュー)。これらの実験の結果は、形質転換 DNA が受容 DNA に紫外線によって導入された潜在的に致命的な DNA 損傷を修復するように働くことを示した。修復を担う特定のプロセスはおそらく HRR であった。細菌の形質転換は、2 つの個体からの相同 DNA の相互作用によって組み換え DNA が形成され、それが次の世代に受け継がれるため、原始的な性的プロセスと見なすことができる。細菌の原核生物の形質転換は、真核生物の減数分裂による有性生殖をもたらした祖先のプロセスであった可能性がある (有性生殖の進化;減数分裂を参照)。

人工的なコンピテンスは、細胞を自然界では通常発生しない条件にさらすことによって、細胞を受動的に DNA を透過できるようにする実験室手順で誘導することができます。^{[43]通常、細胞は、熱パルス (熱ショック) にさらされる前に、低温条件下で}二価 カチオン(多くの場合、塩化カルシウム)を含む溶液中で培養されます。塩化カルシウムは細胞膜​​を部分的に破壊し、組み換え DNA が宿主細胞に侵入できるようにします。DNA を取り込むことができる細胞はコンピテント細胞と呼ばれます。

20 mM Mg中でグラム陰性細菌を増殖させると、イオン結合と共有結合の比率が上昇してタンパク質とリポ多糖の結合数が減少し、膜の流動性が高まり、変換が促進されることがわかっています。 ^[44]ここでのリポ多糖の役割は、より短いO側鎖がより効果的に変換されるという観察から確認されています。これはおそらくDNAのアクセシビリティが向上したためです。

大腸菌などの細菌の表面は、細胞表面のリン脂質やリポ多糖類によって負に帯電しており、DNA も負に帯電しています。したがって、二価陽イオンの機能の 1 つは、リン酸基やその他の負電荷を調整して電荷を保護し、DNA 分子が細胞表面に付着できるようにすることです。

大腸菌細胞へのDNAの進入は、接着帯またはバイエル接合部と呼ばれるチャネルを通じて行われ、典型的な細胞には400もの接着帯がある。これらのチャネルの役割は、コバラミン（これもこれらのチャネルを使用する）がDNAの取り込みを競合的に阻害することが発見されたときに確立された。DNAの取り込みに関与する別のタイプのチャネルは、ポリ（HB）：ポリP：Caで構成される。このポリ（HB）はDNA（それ自体がポリリン酸）を包み込み、Caイオンによって形成されるシールドで運ばれると考えられている。^[44]

細胞を低温状態で二価陽イオンにさらすと、細胞表面の構造が変化または弱まり、DNA の透過性が高まる可能性もあると考えられています。熱パルスにより細胞膜全体に熱不均衡が生じ、DNA が細胞孔または損傷した細胞壁から細胞内に侵入すると考えられています。

電気穿孔法は、コンピテンスを促進するもう 1 つの方法です。この方法では、細胞に10 ～ 20 kV /cmの電界を短時間かけてショックを与え、細胞膜に穴を開けてプラスミド DNA が侵入できるようにすると考えられています。電気ショックの後、穴は細胞の膜修復機構によって急速に閉じられます。

サッカロミセス・セレビシエを含むほとんどの酵母種は、環境中の外来DNAによって形質転換される可能性がある。実験室でこの形質転換を高頻度に促進するためのいくつかの方法が開発されている。^[45]

• 酵母細胞は酵素処理によって細胞壁を分解し、スフェロプラストを生成する。これらの細胞は非常に壊れやすいが、外来DNAを高率に取り込む。^[46]
• 酵母細胞をセシウムやリチウムなどのアルカリ陽 イオンにさらすと、細胞はプラスミドDNAを取り込むことができる。^{[47]その後のプロトコルでは、}酢酸リチウム、ポリエチレングリコール、一本鎖DNAを使用してこの形質転換法を採用した。 ^[48]これらのプロトコルでは、一本鎖DNAが酵母細胞壁に優先的に結合し、プラスミドDNAが結合するのを防ぎ、形質転換に利用できるようにしている。^[49]
• 電気穿孔法：電気ショックを用いて細胞膜に一時的な穴を開ける。これにより、細菌の場合と同様にDNAが侵入できるようになる。^[50]
• 酵母細胞の形質転換には、酵素消化^[51]やガラスビーズによる撹拌^[52]も用いられる。

効率– 酵母の属や種によって、外来DNAの取り込み効率は異なります。^{[53]また、ほとんどの形質転換プロトコルはパン酵母である}S. cerevisiae用に開発されているため、他の種には最適ではない可能性があります。 同じ種であっても、異なる株では形質転換効率が異なり、3桁も異なる場合もあります。 たとえば、S. cerevisiae株を10 ugのプラスミドYEp13で形質転換した場合、DKD-5D-H株では550～3115個のコロニーが得られましたが、OS1株では5個未満のコロニーが得られました。^[54]

DNA を植物細胞に導入する方法は数多くあります。ベクターを介した方法には次のようなものがあります。

• アグロバクテリウムを介した形質転換は、最も簡単でシンプルな植物の形質転換です。植物組織（多くの場合、葉）を10 x 10 mmなどの小片に切断し、アグロバクテリウムを懸濁した液体に10分間浸します。細菌は、切り口で露出した多くの植物細胞に付着します。植物細胞は、傷に関連したフェノール化合物を分泌し、それが今度はアグロバクテリウムの毒性オペロンをアップレギュレーションする働きをします。毒性オペロンには、細菌のタンパク質とDNA（境界配列と呼ばれる特定の認識モチーフによって区切られ、毒性プラスミドから一本鎖として切り取られる）から線毛と呼ばれる構造を通して植物細胞に輸出するタイプIV分泌システムの一部であるタンパク質をコードする多くの遺伝子が含まれます。移入された DNA (T-DNA と呼ばれる) は、アグロバクテリウム タンパク質 VirD2 に存在する核局在シグナルによって植物細胞核に誘導され、このシグナルは T-DNA の右境界 (RB) の末端に共有結合します。T-DNA が宿主植物ゲノム DNA に正確にどのように統合されるかは、植物生物学研究の活発な分野です。選択マーカー (抗生物質耐性遺伝子など) が T-DNA に含まれていると仮定すると、形質転換された植物組織を選択培地で培養してシュートを生成できます。その後、シュートは別の培地に移され、根の形成が促進されます。トランスジェニック シュートから根が成長し始めると、植物を土壌に移して通常のライフサイクルを完了できます (種子を作る)。この最初の植物 (最初のトランスジェニック世代を意味する T1 と呼ばれる) からの種子は、選択培地 (抗生物質を含む) に植えることができます。または、除草剤耐性遺伝子が使用されている場合は、代わりに土壌に植え、後で除草剤で処理して野生型の分離株を殺すこともできます。シロイヌナズナなどの一部の植物種は、花または植物全体をアグロバクテリウムツメファシエンス（通常はC58株、C=チェリー、58=1958、ニューヨーク州イサカのコーネル大学の果樹園のチェリーの木からこの特定のA. ツメファシエンス株が分離された年）の懸濁液に浸すことで形質転換することができます。この方法による形質転換が困難な植物は依然として多くありますが、この方法でうまく改変された種のリストに引き続き追加される研究が進行中です。
• ウイルスによる形質転換（形質導入）：目的の遺伝物質を適切な植物ウイルスにパッケージ化し、この改変されたウイルスが植物に感染するようにします。遺伝物質が DNA の場合、染色体と組み換えられて形質転換細胞が生成されます。ただし、ほとんどの植物ウイルスのゲノムは、感染した細胞の細胞質で複製される一本鎖RNAで構成されています。このようなゲノムの場合、挿入された遺伝子は細胞の核に到達せず、宿主ゲノムに組み込まれないため、この方法はトランスフェクションの一種であり、実際の形質転換ではありません。感染した植物の子孫はウイルスフリーであり、挿入された遺伝子もありません。

ベクトルを使用しない方法には次のようなものがあります。

• 遺伝子銃: 粒子衝撃法、マイクロプロジェクタイル衝撃法、またはバイオリスティックスとも呼ばれます。金またはタングステンの粒子に DNA をコーティングし、若い植物細胞または植物の胚に撃ち込みます。一部の遺伝物質は細胞内に留まり、細胞を形質転換します。この方法では、植物のプラスチドの形質転換も可能です。形質転換の効率はアグロバクテリウムを介した形質転換よりも低くなりますが、ほとんどの植物はこの方法で形質転換できます。
• 電気穿孔法：高電界強度の電気パルスを用いて細胞膜に一時的な穴を開ける。これにより、細菌の場合と同様にDNAが侵入できるようになる。^[55]

遺伝子組み換え菌類を生産する方法はいくつかありますが、そのほとんどは植物に使用される方法と類似しています。ただし、菌類は顕微鏡的および生化学的特性が異なるため、異なる方法で処理する必要があります。

• 大きな問題は、一部の菌類が二核状態にあることです。二核細胞には、それぞれの親菌類から1つずつ、2つの半数体核が含まれています。これらのうちの1つだけが形質転換した場合（これが原則です）、形質転換した核の割合は胞子形成ごとに減少します。 [ ^56]
• 真菌の細胞壁は非常に厚く、DNAの取り込みを妨げるため、（部分的な）除去が必要になることが多い。^[57]時には完全な分解が必要になることもあるが、^{[56] それにより}プロトプラストが得られる。
• 菌糸菌は糸状の菌糸から成り、菌糸は細胞壁で区切られているが、細胞壁は栄養分や細胞小器官、時には核さえも通過できるほど大きな孔で分断されている。そのため、個々の細胞を分離することは通常できない。これは、隣接する形質転換細胞が、抗生物質耐性のための栄養素やタンパク質を供給するなどして、形質転換されていない細胞を選択処理に対して耐性にしてしまう可能性があるため、問題となる。^[56]
• さらに、これらの菌類の成長（およびそれによる有糸分裂）は菌糸の先端でのみ起こるため、これも問題を引き起こす可能性があります。^[56]

前述のように、植物の形質転換に使用されるさまざまな方法は、真菌にも有効です。

• アグロバクテリウムは植物だけでなく真菌にも感染するが、植物とは異なり、真菌はアグロバクテリウムの感染を誘発するために必要なフェノール化合物を分泌しないため、アセトシリンゴンの形で添加する必要がある。^[56]
• 真菌における小さなRNAの発現システムが開発されたおかげで、真菌細胞へのCRISPR/CAS9システムの導入が可能になった。 ^[56] 2016年にUSDAは、子実体の褐変を防ぐためにCRISPR/CAS9で編集された白ボタンマッシュルームの株を規制しないと宣言し、CRISPR/CAS9で編集された作物を市場に出すことについて幅広い議論を引き起こした。^[58]
• 電気穿孔法、バイオリスティックス（遺伝子銃）、超音波によって生成された気泡の空洞化を利用して細胞膜を貫通するソノポレーションなどの物理的方法も真菌に適用できます。 ^[59]

動物細胞への DNA の導入は通常、トランスフェクションと呼ばれ、対応する記事で説明されています。

細菌における人工的に誘導された能力の発見により、大腸菌などの細菌は、タンパク質の発現だけでなく、DNAの操作のための便利な宿主として利用できるようになりました。通常、大腸菌の形質転換にはプラスミドが使用されます。細胞内で安定して維持されるためには、プラスミドDNA分子には複製起点が含まれていなければなりません。これにより、細胞自身の染色体の複製とは独立して、細胞内で複製できるようになります。

有能な培養物が外来 DNA を取り込み、その遺伝子を発現する効率は形質転換効率と呼ばれ、使用した DNA 1 μg あたりのコロニー形成単位 (cfu) で測定されます。pUC19 のような小さなプラスミドの場合、形質転換効率 1×10 ⁸ cfu/μgは、使用したプラスミドの 2000 分子のうち 1 分子が形質転換されることにほぼ相当します。

塩化カルシウム変換では、細胞をCa存在下で冷却することによって細胞を調製する。^2歳以上
（ CaCl中
₂化学的手法では、細胞をプラスミド DNAに対して透過性のある状態にします。細胞を氷上で DNA とともにインキュベートし、短時間ヒートショックを与えます (例: 42 °C で 30～120 秒間)。この方法は、環状プラスミド DNA に非常に有効です。市販されていない調製物では通常、プラスミド 1 μg あたり 10 ⁶～ 10 ^{7 個}の形質転換体が得られます。粗悪な調製物では約 10 ⁴ /μg 以下になりますが、良質のコンピテント細胞調製物ではプラスミド 1 μg あたり最大約 10 ^{8個のコロニーが得られます。 [60]ただし、10 9}を超える形質転換効率を生み出す可能性のあるスーパーコンピテント細胞を作成するためのプロトコルが存在します。^[61]ただし、この化学的手法は、染色体 DNA の断片などの線状 DNA にはうまく機能しません。これは、細胞本来のエキソヌクレアーゼ酵素が線状 DNA を急速に分解するためと考えられます。対照的に、天然にコンピテントな細胞では、通常、プラスミド DNA よりも線状 DNA の方が効率的に形質転換されます。

CaClを用いた形質転換効率
₂この方法はプラスミドのサイズとともに減少するため、大きなプラスミドDNAの取り込みには電気穿孔法の方が効果的な方法である可能性がある。^[62]電気穿孔法で使用する細胞は、電気穿孔法の過程で火花を発生する可能性のある荷電粒子を除去するために、最初に冷たい再蒸留水で洗浄して準備する必要がある。

形質転換により、通常、比較的少数の形質転換細胞と大量の非形質転換細胞の混合物が生成されるため、プラスミドを獲得した細胞を選択する方法が必要である。^[63]したがって、プラスミドには、プラスミドを持たない細胞を殺すか、成長を停止させるための選択マーカーが必要である。抗生物質耐性は、原核生物の最も一般的なマーカーである。形質転換プラスミドには、細菌が通常は感受性である抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が含まれている。処理された細胞の混合物は、抗生物質を含む培地で培養され、形質転換細胞のみが成長できるようになる。別の選択方法は、特定のアミノ酸、ヌクレオチド、または糖の代謝能力の欠如を補うことができる特定の栄養要求性マーカーを使用することである。この方法では、特定の生体分子の合成または有用性が欠如している適切に変異した株を使用する必要があり、形質転換細胞は、プラスミドを含む細胞のみが成長できる培地で培養される。

クローニング実験では、形質転換に使用するプラスミドに遺伝子が挿入されることがあります。しかし、このような実験では、すべてのプラスミドに挿入に成功した遺伝子が含まれているわけではありません。そのため、挿入されたプラスミドを含む形質転換細胞をスクリーニングするために、さらに追加の技術が使用されることがあります。青白スクリーニングで使用されるβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子などのレポーター遺伝子をマーカーとして使用できます。このスクリーニング方法は、プラスミド内のlacZ遺伝子のフラグメント( lacZα ) が細胞内の別の変異lacZ遺伝子 ( lacZΔM15 ) を補完できるという α補完の原理に依存しています。両方の遺伝子は単独では非機能的なペプチドを生成しますが、 lacZ-αを含むプラスミドがlacZΔM15細胞に形質転換された場合のように一緒に発現すると、機能的な β-ガラクトシダーゼを形成します。活性 β-ガラクトシダーゼの存在は、細胞がX-gal を含むプレートで増殖し、特徴的な青いコロニーを形成するときに検出できます。しかし、目的の遺伝子をプラスミドベクターに連結できるマルチクローニングサイトは、 lacZα遺伝子内にあります。したがって、連結が成功するとlacZα遺伝子が破壊され、機能的なβ-ガラクトシダーゼは形成されず、白いコロニーが生成されます。連結に成功した挿入物を含む細胞は、その白色により、連結に失敗した青い挿入物と簡単に識別できます。

他によく使用されるレポーター遺伝子には、青色光の下で緑色に光る細胞を生成する緑色蛍光タンパク質(GFP) や、ルシフェリンとの反応を触媒して光を発する酵素ルシフェラーゼがあります。組み換え DNA は、放射性 RNA プローブによる核酸ハイブリダイゼーションなどの他の方法を使用して検出することもできますが、プラスミドから目的のタンパク質を発現した細胞は、免疫学的方法を使用して検出することもできます。

• 細菌の形質転換（Flash アニメーション）
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