青白画面

青白スクリーニングは、ベクターを用いた分子クローニング実験において、組換え細菌を迅速かつ簡便に検出できるスクリーニング技術です。このスクリーニング法は通常、適切な細菌株を用いて行われますが、酵母などの他の生物も使用できます。形質転換DNAをベクターに連結します。次に、ベクターを形質転換可能なコンピテント細胞に挿入し、 X-gal存在下で培養します。組換えDNAを含むベクターで形質転換された細胞は白色のコロニーを形成し、非組換えプラスミド（すなわちベクターのみ）で形質転換された細胞は青色のコロニーを形成します。

分子クローニングは、分子生物学で最も一般的に用いられる手法の一つです。目的の遺伝子をライゲーションによってプラスミドベクターに挿入し、そのプラスミドを大腸菌細胞に形質転換します。しかし、細胞に形質転換されたプラスミドすべてに目的の遺伝子が挿入されているとは限らず、個々のコロニーごとに挿入の有無を確認するのは時間がかかります。そのため、挿入を検出する方法があれば、この手順の時間と労力を軽減できます。挿入を検出するために開発された初期の方法の一つに、細菌コロニーの色によってクローニング反応の成功例を識別できる青白スクリーニングがあります。

この方法は、 β-ガラクトシダーゼ遺伝子のα相補の原理に基づいています。このα相補現象は、フランソワ・ジャコブとジャック・モノの研究室でアグネス・ウルマンが行った研究で初めて実証されました。この研究では、配列が欠失した不活性変異型β-ガラクトシダーゼの機能が、同じ配列であるα供与ペプチドがそのまま残っているβ-ガラクトシダーゼの断片によって回復されることが示されました。^{[ 1 ]} ラングレーらは、機能しない変異型β-ガラクトシダーゼは、N末端の一部が欠失しており、残基11～41が欠失しているが、β-ガラクトシダーゼの残基3～90からなるペプチドによって相補できることを示しました。^{[ 2 ]}最初の145アミノ酸をコードする配列を含むM13フィラメントファージは、後にメッシングらによって構築されました。また、ベクターを用いたα相補性は、不活性タンパク質を含む細胞をファージに感染させ、その後X-galを含むプレートで培養した際に青色プラークが形成されることで実証された。^{[ 3 ]}

VieiraとMessingによるpUCシリーズのプラスミドクローニングベクターはM13システムから開発され、このスクリーニング方法を利用するために構築された最初のプラスミドであった。^{[ 4 ]} この方法では、プラスミドに連結されたDNAがαペプチドを破壊し、相補プロセスが阻害されるため、機能的なβ-ガラクトシダーゼは形成されない。したがって、挿入配列を含むプラスミドで形質転換された細胞は白色のコロニーを形成し、挿入配列を含まないプラスミドで形質転換された細胞は青色のコロニーを形成する。したがって、連結が成功した結果は、失敗した青色の細胞から形成された白色の細胞によって容易に識別できる。^{[ 5 ]}

β-ガラクトシダーゼは、 lacオペロンのlacZ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、活性状態ではホモ四量体として存在します。しかし、大腸菌M15株由来の変異型β-ガラクトシダーゼは、N末端の11～41番目のアミノ酸残基が欠失しており、この変異体（ω-ペプチド）は四量体を形成できず、不活性です。ところが、この変異型タンパク質は、タンパク質のN末端断片であるα-ペプチドが存在すると、活性型の四量体状態に完全に回復します。α-ペプチドによる変異型β-ガラクトシダーゼの機能回復は、α相補性と呼ばれます。

このスクリーニング方法では、宿主となる大腸菌株はω-ペプチドを含むlacZ遺伝子欠損変異体（lacZΔM15 ）を保持しており、一方、使用されるプラスミドはβ-ガラクトシダーゼの最初の59残基をコードするlacZα配列、すなわちα-ペプチドを保持している。どちらも単独では機能しない。しかし、 lacZα配列を含むプラスミドをlacZΔM15細胞に形質転換するなどして、2つのペプチドが一緒に発現されると、機能的なβ-ガラクトシダーゼ酵素が形成される。

青白スクリーニング法は、このα相補性プロセスを阻害することによって機能します。プラスミドはlacZα配列内に内部マルチクローニングサイト（MCS）を有しています。lacZα配列内のこのMCSは制限酵素によって切断され、外来DNAがlacZα遺伝子内に挿入されることで、αペプチドを生成する遺伝子が破壊されます。その結果、挿入されたプラスミドを含む細胞では、機能的なβ-ガラクトシダーゼは形成されません。

活性β-ガラクトシダーゼの存在は、無色のラクトース類似体であるX-galによって検出できます。X-galはβ-ガラクトシダーゼによって切断され、5-ブロモ-4-クロロインドキシルを生成します。このインドキシルは自発的に二量体化および酸化され、鮮やかな青色の不溶性色素である5,5'-ジブロモ-4,4'-ジクロロインジゴを生成します。これにより、機能的なβ-ガラクトシダーゼを含む細胞は特徴的な青色を呈します。したがって、青色のコロニーは、lacZα遺伝子が途切れていない（つまり挿入配列がない）ベクターが含まれている可能性を示し、一方、X-galが加水分解されない白色のコロニーは、 lacZα遺伝子に挿入配列が存在し、活性β-ガラクトシダーゼの形成を阻害していることを示しています。

組換えクローンは、形質転換コロニーから少量のプラスミドDNAを分離・精製し、制限酵素を用いてクローンを切断し、目的の断片が存在するかどうかを判断することで、さらに分析することができる。^{[ 6 ]} DNAの配列決定が必要な場合は、制限酵素を用いて切断するか、他のアッセイを行うかにかかわらず、コロニーからプラスミドを分離する必要がある。

青白スクリーニングを計画する際には、適切なベクターとコンピテントセルを選択することが重要です。プラスミドにはlacZαが含まれている必要があり、そのようなプラスミドの例としてはpUC19やpBluescriptなどがあります。大腸菌細胞には、欠失配列を持つ変異型lacZ遺伝子（lacZΔM15など）が含まれている必要があり、このような遺伝子型を持つ一般的な細胞としてはJM109、DH5α、XL1-Blueなどがあります。また、lacオペロンはグルコースの存在によって影響を受けることも理解しておく必要があります。グルコースの細胞内輸送に関与するタンパク質EIIA ^Glcは、グルコースが細胞内に輸送される際にラクトース透過酵素の働きを阻害します。したがって、寒天培地にはグルコースが含まれていてはなりません。

X-galは光に敏感であるため、その溶液およびX-galを含むプレートは暗所で保管する必要があります。lac オペロンの誘導物質として機能するイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）は、LacZの発現を促進するために培地に添加することができます。

X-galは高価な材料であるため、細菌をスクリーニングするために他の方法が開発されてきました。GFPは、細菌のスクリーニングを支援する代替手段として開発されました。この概念は、DNA挿入によってベクター内のコード配列が破壊され、GFPの産生が阻害されて蛍光を発しない細菌になるというα相補性に似ています。^{[ 7 ]}組換えベクター（ベクター＋挿入）を持つ細菌は白色でGFPタンパク質を発現しませんが、非組換え（ベクター）の細菌は発現し、UV光の下で蛍光を発します。GFPは一般的にレポーター遺伝子として使用され、クローンが研究者が分析している遺伝子を持っているかどうかを明確に判断できます。コロニーが成長する培地がスクリーニングに影響を与え、偽陽性の結果をもたらすことがあります。^{[ 8 ]}培地上のX-galが分解して青色になったり、培地のためにGFPが蛍光を失ったりすることがあり、目的の組換え体を持つコロニーと持たないコロニーを研究者が判別する能力に影響を与える可能性があります。^{[ 9 ]}

• 相補性試験
• pBLU
• pGreen
• pUC19
• 組換えDNA