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ソノポレーション、または細胞超音波処理は、超音波範囲の音を使用して細胞膜の透過性を高める方法です。この技術は通常、分子生物学や非ウイルス性遺伝子治療で、トランスフェクションまたは形質転換と呼ばれる細胞破壊プロセスで、 DNAなどの大きな分子を細胞に取り込むために使用されます。ソノポレーションは、マイクロバブルの音響キャビテーションを利用して、これらの大きな分子の送達を強化します。[1]ソノポレーションによる膜移行の正確なメカニズムは不明のままであり、現在いくつかの異なる仮説が検討されています。
ソノポレーションは、組織培養細胞、特に哺乳類細胞への外来遺伝子の導入について活発に研究されています。ソノポレーションは、生体内での標的遺伝子治療での使用についても研究されています。これは、患者に改変されたDNAを投与し、超音波トランスデューサーがこの改変されたDNAを患者の体の特定の領域に標的化する医療治療シナリオです。[2]この技術の生物活性は電気穿孔法と似ており、場合によっては電気穿孔法よりも優れていることがわかっています。低周波（< MHz）超音波への長時間曝露は完全な細胞死（破裂）を引き起こすことが実証されているため、この技術を使用する際には細胞の生存率も考慮する必要があります。
装置
ソノポレーションは専用のソノポレーターを使用して実行されます。また、ベンチトップ機能発生器と音響増幅器に接続された特注の圧電トランスデューサーを使用してソノポレーションを実行することもできます。一部のアプリケーションでは、標準的な超音波医療機器も使用できます。
ソノポレーションで使用される音響の測定は、診断用超音波への曝露が圧力に基づく非熱作用によって有害な生物学的効果を生み出す可能性を定量化する機械的指数の観点からリストされています。[3]
マイクロバブル造影剤
マイクロバブル 造影剤は、一般的に超音波の音響効果を高めるために造影超音波アプリケーションで使用されます。特にソノポレーションでは、分子治療薬の膜移行を大幅に強化するためにマイクロバブルが使用されます。[4]
一般的な特徴
現在使用されているマイクロバブルは、ガスコアとそれを取り囲むシェルで構成されています。これらの要素の構成は、望ましい物理的および化学的特性に応じて異なる場合があります。[5]マイクロバブルのシェルは、脂質、ガラクトース、アルブミン、またはポリマー で形成されています。ガスコアは、空気または窒素やパーフルオロカーボンなどの重ガスで構成できます。[6]
作用機序
マイクロバブルの ガスコアは、液体環境に比べて圧縮性が高く、音響アプリケーションに対する応答性が高い。超音波刺激の結果、マイクロバブルは膨張と収縮を起こし、安定キャビテーションと呼ばれる現象が発生する。マイクロバブルが細胞膜に付着している場合、超音波刺激によって生成されたマイクロバブルの振動により細胞膜が押し引きされ、膜の開口部が形成される可能性がある。これらの急速な振動は、マイクロストリーミングと呼ばれる隣接流体の流れにも関与し、周囲の細胞への圧力を高め、細胞集団全体にさらなるソノポレーションをもたらす。[7]マイクロバブル強化ソノポレーションに関与すると考えられる物理的メカニズムは、プッシュ、プル、マイクロストリーミング、トランスレーション、ジェッティングと呼ばれている。[8]
膜移行機構
ソノポレーション中に分子が細胞膜バリアを通過するメカニズムは不明のままです。バリア透過性と分子送達を説明できる可能性のあるさまざまな理論が存在します。有力な仮説には、孔形成、エンドサイトーシス、膜損傷などがあります。
孔形成
超音波照射後の細孔形成は、1999年に255 kHzの超音波照射後に細胞膜のクレーターを観察した研究で初めて報告されました。[9]その後、デキストラン分子の超音波穿孔法によるマイクロインジェクションにより、膜透過性のメカニズムはデキストラン分子のサイズによって異なることが示されました。3～70 kDaのデキストラン分子のマイクロインジェクションは、一時的な細孔を介して細胞膜を通過したことが報告されました。対照的に、155 kDaと500 kDaのデキストラン分子は主に小胞様構造で見られ、エンドサイトーシスのメカニズムを示している可能性があります。[10]この膜挙動の変動性により、超音波の振幅と持続時間に応じた膜破裂と再密閉特性を調査する他の研究が行われています。
エンドサイトーシス
超音波に対するさまざまな細胞反応は、エンドサイトーシスによる分子取り込みのメカニズムを示唆している。観察されたこれらの反応現象には、イオン交換、過酸化水素、および細胞内カルシウム濃度などがある。研究では、パッチクランプ法を使用して膜電位イオン交換をモニタリングし、ソノポレーションにおけるエンドサイトーシスの役割について調べている。細胞および隣接するマイクロバブルへの超音波の適用は、顕著な細胞膜過分極と進行性細胞内カルシウム増加を引き起こすことが示されており、これはマイクロバブルの振動に反応してカルシウムチャネルが開く結果であると考えられている。これらの知見は、超音波の適用が、従来のエンドサイトーシス経路で見られるクラスリン被覆ピットのカルシウム媒介脱被覆を誘発することを裏付けるものである。 [11] [12]他の研究では、ソノポレーションが過酸化水素の形成を誘発することが報告されているが、これはエンドサイトーシスに関与することが知られている細胞反応である。[9]
膜創傷
超音波穿孔法によって生じたせん断力の結果として、細胞膜に機械的に生じた傷が観察されている。これらの傷の性質は音響キャビテーションの程度によって異なり、膜のブレブ形成から瞬間的な細胞溶解まで、さまざまな細胞挙動を引き起こす。膜の傷を調べた複数の研究では、ATPと細胞内小胞の補充に依存するプロセスである再密封行動が観察されていると指摘されている。[9]
膜の再シール
ソノポレーションによる膜透過化の後、細胞は「修復可能なソノポレーション」と呼ばれる現象を通じて膜開口部を自動的に修復することができます。 [13]膜の再密封プロセスはカルシウム依存性であることが示されています。この特性は、膜修復プロセスがカルシウムの細胞内流入に反応した細胞の能動的な修復メカニズムに関与していることを示唆している可能性があります。[14]
前臨床研究
試験管内
超音波を使用した分子送達を報告した最初の研究は、超音波穿孔法を使用してプラスミドDNAを培養マウス線維芽細胞に移すことを試みた1987年のin vitro研究でした。 [15] G418抗生物質耐性を付与するこのプラスミドDNAトランスフェクションの成功は、最終的にプラスミドDNAとsiRNAのin vivoでの超音波穿孔トランスフェクションの可能性を示唆するさらなるin vitro研究につながりました。
生体内
超音波による生体内薬物送達は1991年に初めて報告され[15]、その後もソノポレーションに関する多くの前臨床研究が行われました。この方法は、脳卒中、がん、パーキンソン病、アルツハイマー病など、さまざまな疾患の治療薬や遺伝子の送達に使用されています。[13]ソノポレーションの前臨床的有用性は、過去の腫瘍放射線治療によって十分に実証されており、電離放射線と超音波による微小気泡の血管破壊を組み合わせると、10倍以上の細胞破壊が報告されています。送達効率が向上することで、治療薬の投与量を適切に減らすことができます。[16]
参考文献
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