変換効率

形質転換効率とは、形質転換と呼ばれる過程において、プラスミドなどの外来DNAを細胞が取り込み、組み込む能力を指します。形質転換効率は通常、細胞に添加したDNAマイクログラムあたりの形質転換体（外来DNAを取り込んだ細胞）の数として測定されます。形質転換効率が高いほど、より多くの細胞がDNAを取り込むことができ、効率が低いほど、取り込むことができる細胞の数が少なくなります。

分子生物学において、形質転換効率は重要なパラメータであり、プラスミドDNAを細胞に導入する様々な方法の能力を評価し、異なるプラスミド、ベクター、宿主細胞の効率を比較するために用いられます。この効率は、DNA導入方法、使用する細胞およびプラスミドの種類、形質転換を行う条件など、多くの要因によって影響を受けます。したがって、形質転換効率の測定と最適化は、遺伝子工学、遺伝子治療、バイオテクノロジーなど、多くの分子生物学応用において重要なステップとなります。

形質転換効率を測定することで、実験から得られた情報を利用して、形質転換がどれだけ効果的に行われたかを評価できます。これは、1 μg のプラスミド DNA によって変化した細胞数を定量化したものです。本質的には、形質転換 実験が成功したことを示す指標です。^{[ 1 ]}細胞過剰条件下で測定する必要があります。^{[ 2 ]}

形質転換効率は通常、全細胞数に対する形質転換細胞数の割合として測定されます。これは、パーセンテージまたはDNAマイクログラムあたりのコロニー形成単位（CFU）で表すことができます。

形質転換効率を測定する最も一般的な方法の 1 つは、コロニー形成アッセイを実行することです。コロニー形成単位 (CFU) を使用して形質転換効率を計算する方法の例を以下に示します。^{[ 3 ]}

1. 適切な抗生物質を含む寒天培地に、既知数の細胞を播種する。
2. プレートを、細胞に適した温度と条件下で一定期間（通常は一晩）培養する。
3. プレート上に増殖したコロニーの数を数えてください。これは、プラスミドDNAを取り込んで発現させた細胞の数を表します。
4. 形質転換効率を計算するには、コロニー数を播種した細胞数で割り、100を掛けます。結果は、形質転換効率をパーセントで表したものです。

例えば、1 × 10⁷^個の細胞を播種し、1000個のコロニーを数えた場合、形質転換効率は次のようになります。(1000/1 × 10⁷ ⁾ × 100 = 0.1%

あるいは、コロニー形成単位（CFU）は、形質転換に使用したDNAのマイクログラムあたりの数として報告することもできます。これは、コロニー数に播種した培養液の量を乗じ、使用したDNA量で割ることによって計算できます。

定量PCR （qPCR） - この方法は、プラスミドDNAが宿主細胞ゲノムには存在しない特定の遺伝子または配列を持っているという事実を利用し、それをqPCRのターゲットとして使用できる。形質転換された細胞内のこの特定の遺伝子または配列のコピー数を定量化することにより、細胞内に存在するプラスミドDNAの量、ひいては形質転換効率を決定することができる。^{[ 4 ]}

蛍光アッセイ- この方法は、蛍光タンパク質またはレポーター遺伝子を含むプラスミドの使用に依存しています。形質転換された細胞は、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によって分析され、蛍光タンパク質を発現する細胞の数を決定します。形質転換効率は、蛍光タンパク質を発現する細胞の割合として計算されます。^{[ 5 ]}

形質転換反応の調製における生存細胞数は 2 × 10 ⁸～ 10 ^{11の範囲である。}大腸菌の調製の最も一般的な方法では、反応あたり約 10 ^{10 個の生存細胞が得られる。}大腸菌の形質転換効率の決定に使用される標準的なプラスミドは、 pBR322または pUC シリーズなどの同様のサイズまたはより小さいベクターである。ただし、形質転換効率を決定するために異なるベクターが使用される場合もある。形質転換には 10 ～ 100 pg の DNA が使用されるが、効率の低い形質転換にはより多くの DNA が必要になる場合がある (一般的に飽和レベルは 10 ng 以上で達成される)。^{[ 6 ]} 

形質転換後、1%と10%の細胞をそれぞれ別々に播種する。播種を容易にするため、必要に応じて培地で細胞を希釈してもよい。さらに希釈することで、より効率的な形質転換が可能となる。

pUC19のような小型プラスミドの場合、 1 × ^10⁸ cfu/μgという形質転換効率は、使用したプラスミド分子の約2000個に1個が細胞内に導入されることにほぼ相当します。大腸菌では、一般的に使用されるほとんどのプラスミドの形質転換効率の理論上の限界は1 × ^10¹¹ cfu/μgを超えます。実際には、pUC19のような小型プラスミドで達成可能な最良の結果は2～4 × ^10¹⁰ cfu/μg程度であり、大型プラスミドではそれよりもかなり低くなります。

個々の細胞は多くのDNA分子を取り込むことができるが、複数のプラスミドの存在は形質転換の成功に大きな影響を与えない。^{[ 7 ]}形質転換効率に影響を与える可能性のある要因はいくつかある。^{[ 2 ]}

プラスミドのサイズ–大腸菌で行われた研究では、形質転換効率はプラスミドのサイズが大きくなるにつれて直線的に低下することがわかった。つまり、大きなプラスミドは小さなプラスミドよりも形質転換効率が低い。^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]}

DNAの形態–超らせん状プラスミドは、弛緩型プラスミドよりもわずかに形質転換効率が高く、弛緩型プラスミドは超らせん状プラスミドの約75%の効率で形質転換される。^{[ 7 ]しかし、線状および一本鎖DNAは、形質転換効率がはるかに低い。一本鎖DNAは、二本鎖DNAよりも10⁴}低い効率 で形質転換される。

培地の組成– 形質転換プロセスで使用される培地の組成は、効率に影響を与える可能性があります。たとえば、特定の培地サプリメントは、細胞の自然な形質転換能を高めることができます。^{[ 10 ]}

細胞の遺伝子型– クローニング株には、細胞の形質転換効率を向上させる変異が含まれている場合があります。たとえば、もともとイノシンを唯一の炭素源として最小培地で細胞が増殖する能力を与えることが発見されたdeoR変異を持つE. coli K12株は、同様の変異を持たない株に比べて4～5倍の形質転換効率があります。E . coliでは形質転換効率が低い直鎖状DNAの場合、recBCまたはrecD変異によって形質転換効率を大幅に向上させることができます。^{[ 11 ]}

培養条件–大腸菌細胞は急速に増殖しているときにコンピテント化されやすいため、コンピテント細胞を調製する際には通常、細胞増殖の初期対数期に細胞を採取します。細胞を採取するのに最適な吸光度は通常0.4前後ですが、細胞株によって異なる場合があります。0.94～0.95という高い値でもコンピテント細胞の収量が高いことがわかっていますが、細胞増殖が速い場合はこれは非現実的です。^{[ 12 ]}

抗生物質の存在– 抗生物質の存在は、非形質転換細胞の増殖を阻害し、抗生物質に耐性のある形質転換細胞を選択することによって、形質転換の効率を高めることができる。例えば、β-ラクタム系抗生物質の使用は、グルタミン酸産生細菌の形質転換効率を高めることが示されている。^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]}

プラスミド複製起点–形質転換プロセスで使用されるプラスミドの複製起点は、いくつかの方法で効率に影響を与える可能性があります。細胞内のプラスミドのコピー数、宿主細胞内の複製起点の活性、およびプラスミド上の遺伝子の発現はすべて効率に影響を与える可能性があります。コピー数の多い複製起点を持つプラスミドは、コピー数の少ない複製起点を持つものよりも一般的にトランスフェクション効率が高く、宿主細胞内で活性のある複製起点を持つプラスミドを使用すると、トランスフェクション効率が高くなります。^{[ 16 ] [ 17 ]}

形質転換条件– コンピテントセルの調製方法、熱ショック時間、熱ショック温度、熱ショック後のインキュベーション時間、使用する培養培地、pH、および各種添加剤はすべて、細胞の形質転換効率に影響を与える可能性があります。ライゲーション混合物中の汚染物質やリガーゼの存在は、エレクトロポレーションにおける形質転換効率を低下させる可能性があり、^{[ 18 ]}エレクトロポレーションにはリガーゼの不活性化またはDNAのクロロホルム抽出が必要になる場合があり、あるいは汚染物質の量を減らすためにライゲーション混合物の10分の1だけを使用することもできます。通常のコンピテントセルの調製では、10⁶～10⁸ cfu/μg DNAの範囲の形質転換効率が得られます^。しかし^、 10億を超える形質転換効率が得られる可能性のある超コンピテントセルを作成するための化学的方法のプロトコルが存在します。^{[ 19 ]}

DNAの損傷– 標準的なアガロースゲル電気泳動法でDNAをわずか45秒間紫外線にさらすと、DNAが損傷し、形質転換効率が著しく低下する可能性があります。 ^{[ 20 ]}ただし、電気泳動バッファーに1 mMの濃度でシチジンまたはグアノシン を加えると、DNAの損傷を防ぐことができます。長時間UVトランスイルミネーターで DNAを扱う必要がある場合は、DNAへの損傷が少ない長波長のUV（365 nm）を使用する必要があります。この長波長のUVは、DNAにインターカレーションされた臭化エチジウムとの蛍光が弱いため、DNAバンドの画像をキャプチャする必要がある場合は、短波長（302または312 nm）のUVを使用できます。ただし、後でライゲーション と形質転換のためにDNAを回収する場合は、このような照射は非常に短い時間に制限する必要があります。

DNAを導入する方法は、形質転換効率に大きな影響を与える。^{[ 21 ]}

細菌細胞の中には、宿主細胞に異質な外来プラスミドを分解できる制限修飾系を持つものがある。これにより、形質転換の効率が大幅に低下する可能性がある。^{[ 27 ] [ 21 ]}これは、外来DNAを標的として破壊する受容細胞内の制限系によるものである。これらのシステムは、メチル化パターンの違いに基づいて外来DNAを認識する。この問題に対処するために、市販のメチラーゼを使用して外来DNAのメチル化を変更したり、受容細胞内の制限活性を低下させたりするなどの戦略が適用されてきた。^{[ 28 ] [ 29 ]}例えば、メチル化陰性変異体を使用したり、熱で制限系を一時的に不活性化したりすることで、受容細胞が外来DNAに制限を課す能力を低下させることができる。^{[ 30 ]}

• 形質転換（遺伝学）

• 細菌形質転換効率計算ツール