塩化カルシウムの変換

塩化カルシウム（CaCl ₂）による形質転換は、原核（細菌）細胞生物学における実験技術です。^[1]細胞懸濁液に塩化カルシウムを加えると、プラスミドDNAとリポ多糖（LPS）の結合が促進されます。正に帯電したカルシウムイオンは、負に帯電したDNA骨格とLPS内部コアの負に帯電した基の両方を引き付けます。その後、プラスミドDNAは、冷却された細胞（+4℃）を短時間で高温（+42℃）に加熱する 熱ショックによって細胞内に入り込むことができます。

フレデリック・グリフィスは、 1928 年に細菌の変異の可能性に関する最初の報告を発表しました。^[2]グリフィスは、マウスが非毒性と呼ばれる「ラフ」タイプの肺炎球菌(肺炎球菌) には屈しなかったが、毒性と呼ばれる「スムース」株には屈したことを観察しました。スムース株の毒性は加熱殺菌で抑えることができます。しかし、非毒性のラフ株を加熱殺菌したスムース株と混合すると、ラフ株はスムース表現型を獲得し、毒性を持つようになりました。グリフィスの研究は、この変化はスムース株から生成された非生物で耐熱性の物質によってもたらされたことを示しています。その後、1944 年にオズワルド・エイブリー、コリン・マクロード、マクリン・マッカーティがこの変異物質をDNAであると特定しました。 ^[3]

DNA は非常に親水性の分子であるため、細菌の細胞膜を透過できないことが多い。そのため、細菌がDNA を内部移行できるようにコンピテント化する必要がある。これは、細菌を高カルシウム濃度の溶液に懸濁することで達成できる。これにより、細菌の細胞に小さな穴が開く^[要出典]。カルシウム懸濁液と、氷上でコンピテント細胞とともにDNAをインキュベートし、その後短時間の熱ショックを与えると、染色体外DNA が細胞内に強制的に侵入することになる。^[4]

これまでの研究によると、コンピテント細胞表面のLPS受容体分子は、むき出しのDNA分子に結合する。^{[1]この結合は、負に帯電したDNA分子と}LPSが二価カチオンと配位錯体を形成することから生じる。DNAはその大きさのため、単独では細胞膜を通過して細胞質に到達できない。CaCl ₂処理細胞の細胞膜は、熱ショック段階で著しく脱分極し、その結果、膜電位の低下によって細胞の内部電位の負の性質が低下し、負に帯電したDNAが細胞の内部に流入できるようになる。その後、膜電位は、その後の冷ショックによって元の値まで上昇する可能性がある。^[4]

コンピテント細胞とは、外来DNAが通り抜けやすいように再設計された細胞壁を持つ細菌細胞である。特別な化学的または電気的処理を行わなければ、大多数の細胞型はDNAを取り込むことができないため、カルシウムイオン処理は細菌をDNAが通り抜けられるように改変するための典型的な手順である。^[5]細菌では、コンピテンスは厳密に制御されており、細菌種によってコンピテンスに関連する特性が異なっている。いくつかの類似点はあるものの、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌によって生成されるコンピテンスタンパク質は異なる。^[6]

自然なコンピテンシーは、細菌が周囲からDNA を獲得する 3 つの方法、すなわち接合、形質転換、形質導入に要約されます。^{[7]形質転換中に}DNA が細胞に挿入されると、受容細胞は形質転換DNA を取り込むためにコンピテント状態と呼ばれる特定の生理学的状態になければなりません。^[6] DNA が細胞の細胞質に入ると、ヌクレアーゼなどの酵素がそれを分解することができます。DNAが細胞自身の遺伝物質と非常に類似している場合、DNA 修復酵素が代わりにそれを染色体と再結合させます。^[8]

明らかに、細胞の遺伝子には人工的なコンピテンスに関する情報は含まれていません。この種のコンピテンスには、細胞がDNAを透過できるように、自然界にはあまり存在しない条件を作り出す実験室プロセスが必要です。^[9]形質転換の効率は低いことが多いですが、このプロセスは細菌の遺伝子工学に比較的単純かつ迅速に適用できます。冷たいCaCl ₂に細胞を浸すという簡単な手順を考案したMandel と Higa ^{[10]は、合成コンピテント細胞を得るための基礎を提供しました。塩化カルシウム変換や}エレクトロポレーションなどの化学的変換は、大腸菌細胞などの細菌細胞をプラスミドDNAで形質転換するために最も一般的に使用される方法です。^[5]

塩化カルシウム処理は、一般的に大腸菌やその他の細菌の形質転換に使用されます。^[11]細菌細胞によるプラスミドDNAの取り込みを促進し、遺伝子形質転換を促進します。プラスミドDNAは、 CaCl2とともに細胞溶液に添加することでLPSに付着することができます。^[12]したがって、熱ショックを与えると、負に帯電したDNA骨格とLPSが結合し、プラスミドDNA_が細菌細胞内に侵入できるようになります。^[13]

このプロセスは、The Undergraduate Journal of Experimental Microbiology and Immunology (UJEMI)プロトコル に従って、次の手順に要約されています。

1. LBブロスで細菌培養物を準備する
2. 主な手順を開始する前に、必要な量の以前に作成した培養物を使用して、必要な量の新鮮なLBブロスを接種します。
3. 4°C、4000rpmで10分間遠心分離して細胞をペレット化する。
4. 上清を捨て、細胞を20mLの氷冷した0.1M CaCl ₂に再懸濁し、すぐに氷上に20分間放置する。
5. ステップ3と同様に遠心分離すると、より拡散したペレットが得られ、コンピテントセルの指標となる。
6. ステップ4と同様に冷たいCaCl _{2に再懸濁する}
7. 上清を捨て、細胞を5mLの氷冷した0.1M CaCl ₂と15%グリセロールに再懸濁してペレットを混ぜる。
8. 効果的な熱ショックを与えるために、懸濁液を滅菌した薄いガラス管に移す。
9. 必要な量のDNAを懸濁液チューブに加え、すぐに氷上に置いておく
10. チューブを42℃のウォーターバスに30秒間置き、すぐに氷に戻して2分間放置します。
11. LBまたはSOC培地1mLを加える
12. 各チューブを新しいフラスコ内の必要なmL LBブロス量に移します。
13. 37°C、200rpmで60分間振とう培養するが、細菌が回復できるように90分間放置することが推奨される。
14. 選択/スクリーニングプレート（例：アンピシリンおよび/またはX-gal）で培養した培養物の1:10および1:100希釈液を、選択に使用する抗生物質を添加したLBプレートに塗布する。
15. 37℃で一晩培養する
16. 最後に、プレート上で分離されたコロニーを観察します

• 塩化カルシウム（CaCl2）の変化のアニメーション
• https://www.youtube.com/watch?v=7Ul9RVYG5CM&ab_channel=NewEnglandBiolabs