分類と構造 分子状水素と窒素からのアンモニアの平衡生成は、全体として負の反応エンタルピー を持つが（Δ H 0 = − 45.2 k J m o l − 1 N H 3 {\displaystyle \Delta H^{0}=-45.2\ \mathrm {kJ} \,\mathrm {mol^{-1}} \;\mathrm {NH_{3}} } 活性化エネルギー は非常に高い(E A = 230 − 420 k J m o l − 1 {\displaystyle E_{\mathrm {A} }=230-420\ \mathrm {kJ} \,\mathrm {mol^{-1}} } [ 1 ] 窒素固定酵素は触媒 として働き、このエネルギー障壁を低減することで、反応が常温で起こるようにする。
一般的なアセンブリは、2つのコンポーネントで構成されています。
ホモ二量体 鉄のみからなるタンパク質で あり、高い還元力を持つ還元酵素 で、電子の供給を担っている。 ヘテロ四量体 MoFeタンパク質は、供給された電子を利用してN₂をNH₃に還元する窒素固定酵素である。 一部 の集合体では、相同な代替タンパク質に置き換えられている。 FeMo補因子 の構造図。窒素固定酵素への結合部位（アミノ酸のシステインとヒスチジン）が示されている。
還元酵素 Feタンパク質、ジニトロゲナーゼ還元酵素またはNifHは、1つの[Fe4S4]クラスターを含む同一のサブユニットの二量体であり、質量 は約60～64kDaである。[ 2 ] フェレドキシン やフラボドキシン などの還元剤 からニトロゲナーゼタンパク質に電子を伝達することである。フェレドキシンまたはフラボドキシンは、次の6つのメカニズムのいずれかによって還元される可能性がある。1.ピルビン酸:フェレドキシン酸化還元酵素による、 水素化酵素 による、3.光合成反応中心 における、4.電子の流れを プロトン駆動力 の散逸に結合させることによる、5.電子分岐 による、または6.フェレドキシン:NADPH酸化還元酵素による。[ 3 ] 電子の伝達には、 ATP の結合と加水分解から得られる化学エネルギーの入力が必要である。 ATPの加水分解はニトロゲナーゼ複合体内の構造変化も引き起こし、Feタンパク質とMoFeタンパク質をより近づけて電子伝達を容易にする。[ 4 ]
窒素固定酵素 MoFeタンパク質は、2つのα サブユニットと2つのβサブ ユニットからなるヘテロ四量体で、質量は約240～250kDaである。[ 2 ] α サブユニットとβサブ ユニットの界面に位置するPクラスターと呼ばれる2つの鉄硫黄クラスターと、 α サブユニット内の2つのFeMo補因子 も含まれている。これらの窒素固定酵素におけるMoの酸化状態は、以前はMo(V)と考えられていたが、最近の証拠ではMo(III)であることが示されている。[ 5 ] モリブドプテリン に結合している)。
Pクラスターのコア（Fe 8 S 7 ）は、中心の硫黄原子で連結された2つの[Fe 4 S 3 ]立方体の形をとる。各Pクラスターは、6つのシステイン残基によってMoFeタンパク質に連結されている。 各FeMo補因子（Fe 7 MoS 9 C）は、[Fe 4 S 3 ]と[MoFe 3 S 3 ]という2つの異なるクラスターから構成され、これらは3つの硫化物イオンによって連結されている。各FeMo補因子は、1つのシステイン 残基と1つのヒスチジン 残基によってタンパク質のα サブユニットに共有結合している。 Feタンパク質からの電子はPクラスターを介してMoFeタンパク質に入り込み、そこで電子はFeMo補因子に伝達される。各FeMo補因子は窒素固定の部位として機能し、N₂は補 因子の中心空洞に結合する。
バリエーション MoFeタンパク質は、Mo補因子が少ない環境では代替の窒素固定酵素に置き換えられる。このような窒素固定酵素には、バナジウム鉄 （VFe; Vnf ）型と鉄鉄（FeFe; Anf ）型の2種類が知られている。どちらも、2つの α サブユニット、2つのβ サブユニット、および2つのδ （場合によってはγ ：VnfG/AnfG）サブユニットの集合体を形成する。δサブユニットは互いに相同であり、αサブユニットとβサブユニット自体もMoFe窒素固定酵素に見られるものと相同である。遺伝子クラスターも相同であり、これらのサブユニットはある程度互換性がある。すべての窒素固定酵素は類似のFe-Sコアクラスターを使用しており、バリエーションは補因子金属にある。[ 6 ] [ 7 ] γ サブユニットはFeFe窒素固定酵素の補因子の結合を助ける。 [ 8 ] [ 9 ]
代替ニトロゲナーゼの遺伝子を持つほとんどすべての天然生物は、通常のMoFeニトロゲナーゼの遺伝子も持っている。[ 9 ] [ 10 ] MoFeニトロゲナーゼは、代替ニトロゲナーゼよりもH +を H2 に還元する際にATPの浪費が少ないため、最も効率的である（下記の#一般的なメカニズム を参照）。Moが存在すると、代替ニトロゲナーゼの発現が抑制され、より効率的な酵素のみが使用される。[ 11 ]
アゾトバクター・ビネランディ anfHDGKORオペロンに組織化されている。このオペロンは機能するために Nif遺伝子 の一部を必要とする。これらの追加の必須遺伝子を組み込んだ最小限の10遺伝子オペロンが研究室で構築された。[ 12 ]
機構 触媒部位を強調表示したニトロゲナーゼ。各ニトロゲナーゼ酵素には、2組の触媒部位が存在する。 金属クラスターの1セットを拡大したニトロゲナーゼ。電子はFe-Sクラスター（黄色）からPクラスター（赤色）へ移動し、FeMo-co（オレンジ色）で終点となる。
一般的なメカニズム 窒素固定酵素内の触媒部位。原子は元素ごとに色分けされている。上：Fe-Sクラスター 中：Pクラスター 下：FeMo-co/Mクラスター ニトロゲナーゼは、窒素固定を 触媒する酵素であり、窒素（N 2 ）をアンモニア（NH 3 ）に還元するプロセスであり、地球上の生命を維持するために不可欠なプロセスです。 [ 13 ] バナジウム（V）ニトロゲナーゼ 、鉄のみ（Fe）ニトロゲナーゼの 3 種類のニトロゲナーゼが存在します。[ 14 ] マメ科植物に 共生する根粒菌などのジアゾ栄養細菌 に 見られるモリブデンニトロゲナーゼは、最も広範に研究されており、したがって最もよく特徴付けられているニトロゲナーゼです。[ 15 ] [ 16 ]バナジウムニトロゲナーゼと鉄のみニトロゲナーゼ は 、 代替ニトロゲナーゼとして特定の [ 15 ] [ 17 ]
Mo-ニトロゲナーゼの反応速度論的枠組み（1）の最近の改良により、N 2 還元に必要な最小エネルギーコストは、これまで想定されていたよりも高く、N 2 あたり約 25 MgATP に相当することが示唆されています。この改訂は、Fe タンパク質から FeMo 補因子への電子移動が常に生産的であるとは限らないという観察に基づいています。これは、MgATP 依存性の構造的ゲーティングによって、かなりの数の非生産的な電子移動サイクルが導入されるためです。これにより、ATP 加水分解と基質還元の間のカップリングの全体的な効率が低下し、結果として触媒に必要な総 ATP 量が増加します。[ 18 ]
すべての窒素固定酵素は、成分 I (ジニトロゲナーゼとも呼ばれる) と成分 II (ジニトロゲナーゼ還元酵素とも呼ばれる) からなる 2 成分系です。成分 I は、モリブデン窒素固定酵素では MoFe タンパク質、バナジウム窒素固定酵素では VFe タンパク質、鉄のみの窒素固定酵素では Fe タンパク質です。[ 13 ] [ 17 ] FeMo 補因子 (FeMo-co、M クラスター) の 2 つの金属クラスターが含まれています。Mo は、バナジウム窒素固定酵素と鉄のみの窒素固定酵素では、それぞれ V または Fe に置き換えられています。[ 13 ] [ 19 ] 2 がNH 3 に還元される。
これらの反応中間体の分光学的特性解析により、窒素固定酵素による窒素還元機構の理解が深まったが、そのメカニズムは依然として活発な研究と議論の対象となっている。以下に、窒素添加前の反応中間体に関する分光学的実験結果を簡単に示す。
E 0 – これは触媒作用が始まる前の酵素の静止状態です。電子常磁性共鳴 （EPR）特性評価により、この種はスピンが3 / 2 であることが示されています。[ 23 ]
E 1 – 1電子還元された中間体は、N 2 下でのターンオーバー中に捕捉された。捕捉された中間体のメスバウアー 分光法は、FeMo-co が 1 より大きい整数スピンであることを示している。[ 24 ]
窒素固定酵素による窒素からアンモニアへの還元に関するLowe-Thorneley速度論モデル。 E 2 – この中間体は、金属クラスターが静止酸化状態にあり、追加された 2 つの電子が架橋水素化物に蓄えられ、追加のプロトンが硫黄原子に結合していると考えられています。変異酵素でこの中間体を単離すると 、 FeMo-co は高スピンであり、スピンは 3/2 であることが示され ます。[ 25 ]
E 3 – この中間体は、1つの架橋水素化物と1つの水素化物を持つ単一還元されたFeMo-coであると提案されている。[ 13 ]
E 4 –ローマ神話の遷移の神 にちなんでヤヌス中間体と呼ばれるこの中間体は、電子プロトン移動のちょうど半分後に位置し、E 0 に崩壊するか、窒素結合に進み触媒サイクルを完了することができます。この中間体は、2 つの架橋ヒドリドと 2 つの硫黄結合プロトンを持つ静止酸化状態の FeMo-co を含むと提案されています。[ 13 ] [ 26 ] 電子核二重共鳴 (ENDOR) 実験により、この中間体の構造に関する洞察が得られ、2 つの架橋ヒドリドの存在が明らかになりました。[ 26 ] 95 Mo および57 Fe ENDOR により、ヒドリドが 2 つの鉄中心間に架橋していることが示されています。[ 27 ] °C でクライオアニーリングすると、緩和時に水素当量 2 個が連続的に失われ、単離された中間体が E 4 状態と一致することが証明された。[ 13 ] E 4 から E 2 + H 2 、そして最終的に E 0 と 2H 2 への崩壊により、E 2 中間体に関連する EPR 信号が確認された。[ 13 ]
上記の反応中間体は、金属クラスターが元の酸化状態と一価還元状態の間を循環し、追加の電子が水素化物に蓄積されることを示唆している。一方、各段階で水素化物の形成が起こり、金属クラスターは実際には元の酸化状態と一価酸化状態の間を循環するという説も提唱されている。[ 13 ]
窒素 固定のための遠位経路と交互経路窒素固定酵素における窒素固定の遠位経路と交互経路。 ヤヌス E 4 複合体以前の窒素固定のメカニズムについては概ね合意が得られているが、メカニズムの後半部分の正確な経路については、現在「遠位」経路と「交互」経路の 2 つの仮説がある。[ 13 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 13 ] [ 28 ] [ 29 ] ニトリド [ 30 ] ジアゼン とヒドラジン などの中間体の単離に焦点を当てている。[ 13 ] [ 13 ] Mo を用いた研究は一般的に遠位経路を示唆し、Fe を用いた研究は一般的に交互経路を示唆している。[ 13 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 31 ] [ 32 ]
遠位経路に対する具体的な支持は主に、モデル錯体で金属中心としてMoを使用してニトリド錯体を単離することに成功したSchrockとChattの研究から生じている。[ 30 ] [ 33 ] 。 [ 31 ] [ 32 ]小さな クラスター も窒素固定の交互経路に従うことが示されている。[ 34 ] [ 13 ] [ 35 ] [ 13 ] [ 28 ] [ 29 ]
MgATP結合のメカニズム MgATPの結合は、窒素固定酵素が用いる機構において起こる中心的な出来事の一つである。MgATPの末端リン酸基の 加水分解 により、Feタンパク質からMoFeタンパク質へ電子を移動させるのに必要なエネルギーが供給される。[ 36 ] アミノ酸 残基との結合相互作用は、類似の酵素と比較することでよく理解されているが、MgATPが結合したFeタンパク質の結晶構造が存在しない（1996年時点）ため、分子の残りの部分との相互作用はより不明瞭である。[ 37 ] [ 20 ] リジン と残基125のアスパラギン酸の間に 塩橋 が存在する。[ 37 ] 部位特異的変異誘発により、 リジンをグルタミン に置換すると、タンパク質の MgATP に対する親和性が大幅に低下することが実証されている[ 38 ] アルギニン に置換すると、塩橋が強すぎるため MgATP が結合できないことも実証されている[ 39 ] 。部位 125 にアスパラギン酸が特に必要であることは、この残基をグルタミン酸 に変異させたときの反応性の変化を観察することによって示されている[ 40 ] [ 40 ] 2+ イオンに配位したままで、ADP 分子の別のリン酸との結合を促進するというモデルが生まれた[ 41 ] [ 20 ] [ 42 ] 変異体と野生型タンパク質のX線散乱 データを比較した結果、MgATP結合時にタンパク質全体が収縮し、半径が約2.0 Å減少するという結論に至った。[ 42 ]
その他の機構の詳細 触媒作用のメカニズム に関する多くの側面は依然として不明である。ニトロゲナーゼに結合した基質に関する結晶構造解析は報告されていない。
ニトロゲナーゼはアセチレンを還元することができるが、一酸化炭素によって阻害される。一酸化炭素は酵素に結合し、それによって二窒素の結合を阻害する。二窒素はアセチレンの結合を阻害するが、アセチレンは二窒素の結合を阻害せず、エチレン への還元には電子が1つしか必要ない。[ 43 ] 酸素 の酸化特性により、ほとんどのニトロゲナーゼは二酸素 によって不可逆的に阻害され、二酸素はFe-S補因子を分解的に酸化する。このため、窒素固定菌は生体内で アゾトバクター科 などの一部の窒素固定菌が好気条件下で酸素不安定性ニトロゲナーゼを利用できるのは、細胞膜 での酸素還元を可能にする高い代謝率 によるものとされているが、70 μM を超える酸素濃度 (周囲の濃度は 230 μM O 2 ) や、その他の栄養制限時には、このようなメカニズムの有効性が疑問視されている。[ 44 ] アゾトバクター・ビネランディイ 酸化ストレス 下では、FeSII の [Fe 2 -S 2 ] クラスターが酸化され、FeSII とニトロゲナーゼの Fe および MoFe サブユニットを含むフィラメント状複合体の形成が引き起こされる。この複合体は、ニトロゲナーゼを不活性だが構造的に保護された状態に固定する。 FeSII の酸化還元感受性構造変化によって駆動されるこの可逆的な「スイッチオフ」機構は、窒素固定酵素を酸素による損傷から保護するために生物が用いる重要な戦略である。[ 45 ] [ 46 ] レグヘモグロビンは、 ヘム 補欠分子族を介して二酸素と結合することができ、窒素固定酵素の活性部位で O 2 を緩衝する上で重要な役割を果たし、同時に効率的な呼吸を可能にする。[ 47 ]
窒素固定酵素を合成する生物 窒素固定に必要なニトロゲナーゼを合成する細菌には2種類あります。それらは以下のとおりです。
自由生活性細菌（非共生細菌 ）の例としては、以下のようなものがある。 共生細菌（相利共生細菌）の例としては、以下のようなものがある。
進化
内部進化 窒素固定酵素は、ローマ数字の I から III で命名された 3 つのグループ、クレード、またはクラスに分けられます。代替窒素固定酵素はクラス III に含まれます。配列比較[ 53 ] AlphaFold 2 で予測された構造の比較からも同じグループ分けが確認できます。Nif-I は主に、大きな Nif 遺伝子ファミリーを持つ好気性または少なくとも通性嫌気性の窒素固定細菌に見られますが、他の 2 つのタイプは、より小さな遺伝子ネットワークを持つ嫌気性窒素固定細菌にほぼ限定的に見られます。[ 54 ] [ 55 ] 大酸化イベント の時期に基づくと、グループ I は 2.5ギガ年 以上前に分岐したことはないと考えられます。[ 53 ]
祖先配列再構築は 、2 つのグループ I 窒素固定酵素の再構築に使用されており、Anc2 はガンマプロテオバクテリアでサンプリングされたすべての窒素固定酵素の祖先を表し、Anc1 は Azotobacter vinelandii 、Agaribacterium haliotis 、および環境サンプルを中心としたより小さなグループを表しています。これらは現代のA. vinelandii バージョンよりも動作が遅いですが、ATP 使用効率は同様です (生成された H 2 と還元された N 2 の比率は、 Anc1B を除いて、約 2.1 でほぼ変化していません。Anc1B はより効率的です)。[ 53 ]
他のタンパク質との類似性 Nif遺伝子 には、Oクラスターと呼ばれるPクラスターの前駆体を組み立ててNifDK に転移させる役割を担う成熟酵素NifENが含まれています。また、窒素固定酵素成分II NifH の助けを借りてMクラスターが組み立てられ、 NifDK に転移される場所でもあります。その構造は窒素固定酵素成分I NifDK とよく似ていますが、通常はPクラスターとLクラスター（Mクラスターの前駆体）を担っています。A . vinelandii 由来のNifENを 成分II NifHとともに 大腸菌 で発現させると、結果として得られるタンパク質の組み合わせは、窒素欠乏培地で形質転換大腸菌 の増殖を促進する窒素固定酵素として生体内で 機能することが証明されています。大腸菌 に自然に存在するYfhLフェレドキシンは NifH と協働することができます。[ 56 ] Nif を持つ生物の中で、NifNは 古細菌にのみ見られます。その理由は不明です。[ 55 ]
NifEN の窒素固定能力とNifDK との類似性に関する一つの解釈は、かつてはPクラスターとLクラスターを持つ単一のニトロゲナーゼが存在し、遺伝子重複と 大酸化イベント 後の利用可能なMo量の増加によって現在の状況が進化するようになった（一方のコピーがMクラスターの獲得によりNifEN となり、もう一方のコピーがPクラスターの喪失によりNifDKとなった）というものである。同位体データは、Moベースの窒素固定が3.2 ギガ年 前より新しいものではないことを示唆している。ニトロゲナーゼ、その成熟酵素、および関連タンパク質のαサブユニットとβサブユニットの間にも類似性があり、2つの半分は当初は機能不明の単一の遺伝子であり、ニトロゲナーゼがBChNBから分岐する前に重複した可能性がある。[ 57 ] 2022年の大規模な研究は、 NifEN とNifDKが 重複によって形成されたという見解を概ね支持している。 [ 55 ]
窒素固定酵素の 3 つのサブユニットは、プロトクロロフィリドを クロロフィル に変換する光非依存性プロトクロロフィリド還元酵素 (DPOR、(ChlNB) 2 + ChlL 2 ) の 3 つのサブユニットと有意な配列類似性を示します。このタンパク質は 裸子植物 、藻類、光合成細菌に存在しますが、被子植物では進化の過程で失われています。構造的類似性から、窒素固定酵素と同じスーパーファミリーに分類されます。[ 58 ] バクテリオクロロフィル の酵素も同様で、クロロフィリド酸化還元 酵素(COR、(BchNB) 2 + BchL 2 または (BchYZ) 2 + BchX 2 )と呼ばれています。[ 59 ]
別個に、窒素固定酵素サブユニットのうち2つ（NifDとNifH）は、例えばMethanocaldococcus jannaschii メタン生成菌 に相同遺伝子を持つ。[ 60 ] 2004年の時点では、これらの「クラスIV」 nif 遺伝子の機能についてはほとんど理解されていないが、[ 61 ] . jannaschii では、これらは互いに相互作用し、構成的に発現することが知られている。[ 60 ] Nifは、DPORやCORよりも Nif -I/II/III（真の窒素固定酵素）に近い。DK対ENの重複はない。このグループは以前は側系統群と考えられていたが、より最近の分析では単系統群で あることがわかった。既知の機能は2種類あり、CfbC型は 補酵素F430 を生成し、Mar 型はメチオニン、エチレン、メタンを生成できる。[ 55 ]
窒素固定酵素活性の測定 多くの酵素活性測定法と同様に、基質（ N₂ ）から生成物（NH₃）への 変換速度を測定することで、ニトロゲナーゼ活性を推定することができます。NH₃は 細胞内の他の反応にも関与しているため、添加した基質の収支または「質量バランス」を示すために、基質を¹⁵N で標識することがしばしば望ましいです。より一般的な測定法であるアセチレン還元アッセイ（ARA）は、酵素がアセチレンガスをエチレンガスに還元する能力を利用して、ニトロゲナーゼの活性を推定します。これらのガスはガスクロマトグラフィーを使用して容易に定量できます。[ 62 ] Clostridium pasteurianum [ 63 ]
残念ながら、ニトロゲナーゼアッセイのデータを還元されたN₂ の実際のモル数に変換することは（特にARAの場合）、必ずしも容易ではなく、さまざまな理由から真の反応速度を過小評価または過大評価する可能性があります。たとえば、H₂はニトロゲナーゼに対して N₂ と競合しますが、アセチレンとは競合しません（ARAによるニトロゲナーゼの過大評価につながります）。ボトルまたはチャンバーベースのアッセイでは、取り扱いによる微小環境の封じ込めや破壊の結果として微生物系に悪影響を及ぼし、ニトロゲナーゼの過小評価につながる可能性があります。これらの弱点にもかかわらず、このようなアッセイはニトロゲナーゼ活性の相対的な速度や時間的パターンを評価するのに非常に有用です。
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