祖先配列の再構築

祖先配列再構築（ASR ）は、祖先遺伝子/配列再構築/復活とも呼ばれ、分子進化の研究で使用される技術です。この方法では、関連する配列を使用して、複数の配列アラインメントから「祖先」遺伝子を再構築します。^[1]

この方法は祖先タンパク質を「復活」させるために使用することができ、1963年にライナス・ポーリングとエミール・ズッカーカンドルによって提案されました。^[2] 酵素の場合、このアプローチは古酵素学（英：palaeoenzymology）と呼ばれています。1980年代と1990年代には、スティーブン・A・ベナーの研究室が主導して、この技術の可能性を示す初期の取り組みがいくつか行われました。^[3]アルゴリズムの改善と、より優れた配列決定および合成技術のおかげで、この方法は2000年代初頭にさらに開発され、より多様でより古い遺伝子の復活が可能になりました。^[4 ]過去10年間で、祖先タンパク質の復活は、タンパク質進化のメカニズムとダイナミクスを明らかにする戦略として発展してきました。^[5]

タンパク質を研究するための従来の進化的および生化学的アプローチ、すなわち生命の樹の異なる枝の末端からの関連タンパク質相同体のいわゆる水平比較とは異なり、ASR は、統計的に推定された祖先タンパク質を樹のノード内で垂直に調査します(右の図を参照)。このアプローチにより、進化の過程で一時的に生じた可能性のあるタンパク質特性にアクセスでき、最近では、現在の配列をもたらした潜在的な選択圧を推測する方法として使用されています。ASR は、機能アッセイを使用して、まず図の祖先「5」と「4」の間にあることを決定することにより、複製後にタンパク質の新機能をもたらした原因となる突然変異を調査するために使用されています。 ^{[6]タンパク質}生物物理学の分野では、ASR は、HX/MS などの多くの最新の分析技術を組み合わせることにより、タンパク質の熱力学的および動力学的ランドスケープの進化、およびタンパク質の折り畳み経路を研究するためにも使用されています。^[7]こうした洞察は、典型的には、系統発生に沿って再構築された複数の祖先から推測される。これは、前述の類推で言えば、生命の樹の中でどんどん上位のノード（進化の時間でどんどん遡るノード）を研究することによって得られる。^[8]

ASR研究のほとんどはin vitroで行われ、進化的に望ましい形質と思われる祖先タンパク質の特性（耐熱性の向上、触媒活性、触媒の乱交性など）が明らかになっています。これらのデータは、ASRアルゴリズムの成果物であるとともに、太古の地球環境の指標となるもので、多くの場合、ASR研究では、アルゴリズムのエラーを軽減するために広範な制御（通常は代替のASR実験）を補完する必要があります。研究されたすべてのASRタンパク質がこのいわゆる「祖先優位性」を示すわけではありません。^[9]新興分野の「進化生化学」は、祖先を特定の細胞コンテキスト内での生物の適応度を調べる方法として利用するASR研究（祖先タンパク質を効果的にin vivoでテストする）の最近の増加によって強化されています。^[8]こうした研究には固有の限界があり、主にこれらの祖先を当てはめるのに適切な古代のゲノムが不足していること、適切に分類された実験モデルシステムのレパートリーが少ないこと、古代の細胞環境を模倣できないことなどから、生体内でのASR研究はほとんど行われていません。上記の障害にもかかわらず、2015年の論文によるこの研究分野への予備的な洞察では、in vitroで観察された「祖先の優位性」が特定のタンパク質の生体内で再現されなかったことが明らかになっています。 ^{[10] ASRは}先カンブリア時代（>541Ma）の生命の生化学を研究するための数少ないメカニズムの1つであり、そのため「古遺伝学」でよく使用されます。実際、ZuckerkandlとPaulingは当初、ASRを「古生化学」と名付けた分野の出発点にしようと考えていました。

関心対象のタンパク質の関連する相同体がいくつか選択され、多重配列アライメント(MSA) で整列され、統計的に推定された配列を枝のノードに持つ「系統樹」が構築されます。これらの配列がいわゆる「祖先」であり、対応する DNA を合成し、それを細胞に変換してタンパク質を生成するプロセスは、いわゆる「再構築」です。祖先配列は通常、最大尤度によって計算されますが、ベイズ法も実装されています。祖先は系統樹から推定されるため、系統樹のトポロジーと構成が、出力される ASR 配列において重要な役割を果たします。系統樹の構築方法については多くの議論や論争があるため (たとえば、好熱細菌が細菌の進化において基底的であるか派生的であるかなど)、多くの ASR 論文では、異なるトポロジー、したがって異なる ASR 配列を持つ複数の系統樹が構築されています。これらの配列は比較され、多くの場合、系統発生ノードごとにいくつか（約 10 個）が表現され、研究されます。ASR は、古代のタンパク質/DNA の実際の配列を再現するのではなく、ノードに実際にあったものと類似している可能性が高い配列を再現すると主張しています。これは、ASR の欠点とは見なされません。なぜなら、ASR はタンパク質進化の「ニュートラル ネットワーク」モデルに適合し、進化の分岐点（ノード）では、遺伝子型は異なるが表現型は類似したタンパク質配列の集団が現存する生物集団に存在するからです。したがって、ASR がノードのニュートラル ネットワークの配列の 1 つを生成する可能性があり、それが現代の配列の最後の共通祖先の遺伝子型を表していないかもしれませんが、表現型を表している可能性があります。^[8]これは、タンパク質の非触媒/機能部位の多くの変異が生物物理学的特性に小さな変化を引き起こすという現代の観察によって裏付けられています。したがって、ASR を使用すると、過去のタンパク質の生物物理学的特性を調べることができ、古代の遺伝学の指標となります。

最大尤度 (ML) 法は、使用される推論方法によって各位置の残基がその位置を占める可能性が最も高いと予測される配列を生成することによって機能します。通常、これは現存する配列から計算されたスコアリング マトリックス( BLASTまたは MSAで使用されるものと同様) です。代替方法には、配列進化モデルに基づいて配列を構築する最大節約(MP) が含まれます。通常、これはヌクレオチド配列の変化の最小数が進化にとって最も効率的なルートを表し、オッカムの剃刀によれば最も可能性が高いという考え方です。MP は、10 億年スケールには適用できないほど進化を単純化しすぎるため、再構築のための最も信頼性の低い方法であると見なされることがよくあります。

もう 1 つの方法は、残基の不確実性を考慮することです。いわゆるベイジアン法です。この形式の ASR は、ML 法を補完するために使用されることもありますが、通常はより曖昧なシーケンスを生成します。ASR では、「曖昧さ」という用語は、明確な置換が予測できない残基の位置を指します。多くの場合、このような場合、曖昧さの大部分を包含し、互いに比較される複数の ASR シーケンスが生成されます。ML ASR では、派生したシーケンスが入力シーケンスの単なるコンセンサス以上のものであることを示すために、補完的な実験が必要になることがよくあります。これは、「祖先の優位性」の観察に特に必要です。^[7]耐熱性が増加する傾向にあることに対する 1 つの説明は、ML ASR が、系統発生全体にわたってタンパク質の軽微な耐熱性を付与するために進化したいくつかの異なる並行メカニズムのコンセンサス シーケンスを作成し、その結果、相加効果が生じて「優れた」祖先の耐熱性をもたらすというものです。^[11]

実験ごとにこの理論を解消するには、コンセンサス配列と非 ML 方法による並列 ASR の表現が必要になることがよくあります。 ML 方法によって生じるもう 1 つの懸念は、スコアリング マトリックスが現代の配列から派生しており、今日見られる特定のアミノ酸の頻度が先カンブリア時代の生物学と同じではない可能性があり、その結果、配列の推論が歪む可能性があることです。 いくつかの研究では、さまざまな方法論を使用して古代のスコアリング マトリックスを構築し、結果として得られた配列とタンパク質の生物物理学的特性とを比較しました。 これらの変更された配列は多少異なる ASR 配列をもたらしますが、観察された生物物理学的特性は実験誤差以外では変化しないようでした。^[12] ASR の「全体論的」性質と、考えられるすべての実験誤差の原因を考慮したときに生じる非常に複雑なため、実験コミュニティでは、ASR の信頼性の究極の測定は、同じノードのいくつかの代替 ASR 再構築の比較と、同様の生物物理学的特性の識別であると考えています。この方法は信頼性の堅牢な統計的、数学的尺度を提供するものではないが、個々のアミノ酸の置換はタンパク質の生物物理学的特性に大きな変化を引き起こさないというASRで使用される基本的な考え方に基づいている。これは推論の曖昧さの影響を克服するためには真実でなければならない原則である。^[13]

ASR に使用される候補は、研究対象となる特定の特性 (例えば、耐熱性) に基づいて選択されることが多い。^[9]特性の範囲の両端 (例えば、好冷性タンパク質と好熱性タンパク質) から、タンパク質ファミリー内の配列を選択することで、ASR を使用して、観察された生物物理学的効果 (例えば、安定化相互作用) をもたらした特定の配列変化を調べることができる。図で、配列「A」が中性 pH で最適に機能するタンパク質をコードし、「D」が酸性条件で最適に機能するタンパク質をコードしている場合、「5」と「2」の間の配列変化は、この違いの正確な生物物理学的説明を示す可能性がある。ASR 実験では、おそらく数十億年前の祖先を抽出できるため、祖先自体と祖先および現存する配列の間には、数十、場合によっては数百の配列変化がしばしば存在する。このため、このような配列機能の進化研究には、多くの作業と合理的な方向性が必要になる可能性がある。^{[1] [6] [14]}

祖先タンパク質がコンピューターで再構築され、生きた細胞株で発現され、そして多くの場合、精製されて生化学的に研究された例は数多くあります。

• ソーントン研究室は、いくつかの祖先のホルモン受容体（約5億年前）^{[4] [15] [16]}を復活させ、スティーブンス研究室と協力して酵母（8億年前）から古代のV-ATPaseサブユニット^[17]を復活させました。
• マルケシー研究室は最近、大腸菌 リボヌクレアーゼH1の進化生物物理学的歴史に関するいくつかの研究を発表しました。^{[9] [18]}

その他の例としては、脊椎動物の祖先の視覚色素、^[19] 糖を分解する酵母の酵素（8億年前）、 ^{[20]抗生物質}耐性をもたらす細菌の酵素（2～3億年前）、^[21] 反芻動物の消化に関与するリボヌクレアーゼ、酵母発酵に関与するアルコール脱水素酵素（Adhs） （約8500万年前）、^[13]およびナス科のRuBisCO などがあげられる。^[22]

再構成された配列の「年齢」は分子時計モデルを使用して決定され、多くの場合、複数のモデルが採用されます。^{[7] [23]}この年代測定技術は、多くの場合、地質学的時点（古代の海洋成分やBIFなど）を使用して較正され、これらの時計は非常に古いタンパク質の年齢を推測する唯一の方法である一方で、誤差範囲が広く、反対のデータに対して防御することが困難です。このため、ASR の「年齢」は、実際には指標としてのみ使用されるべきであり、祖先配列と現代の配列（時計の計算の基礎）間の置換数の測定に完全に優先されることがよくあります。^[9]そうは言っても、時計を使用すると、ASR タンパク質の観察された生物物理学的データを当時の地質学的または生態学的環境と比較することができます。例えば、細菌のEF-Tus （翻訳に関与するタンパク質で、 HGTの影響を受けることはほとんどなく、通常Tenvよりも約2℃高いTmsを示す）に関するASR研究では、先カンブリア時代の地球はより高温であったことが示されており、これは酸素18同位体レベルに基づく古代の地球の海水温に関する地質学的データと非常によく一致している。 ^[12]酵母Adhsに関するASR研究では、エタノール代謝（単なる老廃物の排出ではない）のためのサブ機能化Adhsの出現は、カンブリア紀の肉質果実の夜明けと同時期に起こり、この出現以前は、Adhは過剰なピルビン酸の副産物としてエタノールを排出する役割を果たしていたことが明らかになっている。^[13]時計の使用は、生命の起源が最古の分子化石が示すよりも前（> 4.1Ga）に起こったことを示しているのかもしれないが、分子時計の信頼性には議論の余地があるため、このような観察は慎重に行う必要がある。^{[23] [24]}

一例として、最大40億年前の生物からチオレドキシン酵素を再構築した研究があります。 ^[25]これらの再構築された酵素の化学的活性は現代の酵素と非常に類似していましたが、その物理的性質は熱および酸性に対する安定性が著しく向上していました。これらの結果は、古代の生命が今日よりもはるかに高温で酸性度の高い海で進化した可能性があることを示唆していると解釈されました。^[25]

これらの実験は、進化生物学におけるさまざまな重要な疑問に取り組んでいる。進化は小さなステップで進むのか、それとも大きな飛躍で進むのか、進化は可逆的か、複雑性はどのように進化するのか。ホルモン受容体のアミノ酸配列のわずかな変異が、ホルモンに対する受容体の好みの重要な変化を決定することがわかっている。これらの変化は、内分泌系の進化における大きなステップを意味する。したがって、分子レベルでの非常に小さな変化が莫大な結果をもたらす可能性がある。ソーントン研究室は、グルココルチコイド受容体の研究により、進化が不可逆的であることを示すことにも成功した。この受容体は、コルチゾール受容体の7つの変異によって変化したが、これらの変異を元に戻しても元の受容体は戻らなかった。これは、エピスタシスがタンパク質の進化に大きな役割を果たしていることを示しており、いくつかの並行進化の例の観察と相まって、上記の中立ネットワークモデルを裏付けている。^[8]その他の以前の中立変異はラチェットとして機能し、受容体の変化を不可逆的なものにした。^[26]受容体に関するこれらのさまざまな実験は、タンパク質が進化の過程で大きく分化していることを示しており、これが複雑性がどのように進化するかを説明しています。さまざまな祖先ホルモン受容体とさまざまなホルモンを詳しく見ると、単一のアミノ酸残基とホルモンの化学基との相互作用のレベルで、非常に小さいが特定の変化が生じることがわかります。これらの変化に関する知識は、たとえば、ホルモンの作用を模倣または阻害できるホルモン同等物の合成につながり、新しい治療法の可能性を開く可能性があります。

ASR によって古代の耐熱性と酵素の乱交性への傾向が明らかになったことから、これらの特性をしばしば望むタンパク質エンジニアにとって ASR は貴重なツールとなる（現在の合理的に導かれたツールよりも大きな効果を生み出すこともある）。^[11] ASR はまた、表現型が類似した「古代の生物」を「復活」させることも約束しており、これにより進化生化学者は生命の歴史を探求できるようになる。ベンナーのような ASR の支持者は、これらの実験やその他の実験を通じて、今世紀の終わりには、前世紀の古典化学で生じたのと同等のレベルの生物学の理解が見られるだろうと述べている。^[13]