PCRの変異体

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の汎用性により、さまざまな目的のために設計された多数の変種技術で使用されている基本プロトコルが変更されました。この記事では、分子生物学研究室で現在または過去に使用されていた最も一般的な変種の多くをまとめています。これらの変種技術を理解するには、PCR が機能する基本的な前提と、対応する用語や概念に精通している必要があります。

多くの場合、望ましい目標を達成するには、標準の PCR プロトコルに小さな変更を加えるだけで済みます。

マルチプレックスPCRは、異なる標的配列にアニーリングするプライマーの複数のペアを使用します。これにより、単一のサンプルで複数の標的を同時に分析できます。たとえば、遺伝子変異の検査では、6つ以上の増幅を組み合わせることができます。DNAフィンガープリンティングの標準プロトコルでは、検査される標的は3つまたは4つのグループで増幅されることがよくあります。マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅（ MLPA ）では、1対のプライマーのみを使用して複数の標的を増幅できるため、マルチプレックスPCRの解像度の制限を回避できます。マルチプレックスPCRは、マイクロサテライトやSNPの分析にも使用されています。 ^[1]

可変数のタンデムリピート (VNTR) PCR は、長さの変動を示すゲノムの反復領域をターゲットにします。サンプルの遺伝子型の分析には通常、ゲル電気泳動による増幅産物のサイズ測定が含まれます。短いタンデムリピート(または STR)として知られるより小さな VNTR セグメントの分析は、CODISなどのDNA フィンガープリント データベースの基礎となります。

非対称PCRは、二本鎖DNA標的の一方の鎖を優先的に増幅する。これは、一部のシーケンシング法およびハイブリダイゼーションプローブ法で、産物として1本のDNA鎖を生成するのに用いられる。サーモサイクリングは、プライマーの量を制限したり、プライマーの1つを省略したりすること以外は、従来のPCRとまったく同じように行われる。制限プライマーが枯渇すると、複製は過剰なプライマーの伸長によって指数関数的ではなく算術的に増加する。[ 2 ]この^プロセスの改変版である線形指数PCR （またはLATE-PCR）では、制限プライマーの濃度が反応途中で減少しても反応効率を維持するために、過剰なプライマーよりも融点（T m ）の高い制限プライマーを使用する。[ 3 _]^オーバーラップ伸長PCRも参照。

長いPCRを行うには、いくつかの変更が必要です。オリジナルのクレノウベースのPCRプロセスでは、約400 bpを超える産物は生成されませんでした。しかし、 Taqポリメラーゼは数千bpまでの長さのターゲットを増幅することができます。^[4] それ以来、Taq酵素を使用した改良されたプロトコルにより、50 kbを超えるターゲットを増幅できるようになりました。^[5]

ネスト PCR は、DNA 増幅の特異性を高めるために使用されます。2 セットのプライマーが 2 つの連続した反応で使用されます。最初の PCR では、1 組のプライマーを使用して DNA 産物を生成しますが、これには非ターゲット領域から増幅された産物が含まれる場合があります。最初の PCR からの産物は、結合部位が最初のセット内に配置されている (ネストされている) 1 つ (「ヘミネスト」) または 2 つの異なるプライマーを使用して 2 番目の PCR のテンプレートとして使用され、特異性が向上します。ネスト PCR は、従来の PCR よりも長い DNA 産物を特異的に増幅する効果が高いことがよくありますが、ターゲットの配列に関するより詳細な知識が必要です。

定量PCR（ qPCR）は、サンプル内のターゲットDNA（またはRNA）の特定の量を測定するために使用されます。真の指数関数的増加のフェーズ内でのみ増幅を測定することにより、測定された生成物の量はターゲットの初期量をより正確に反映します。増幅中に生成物の量を監視する特別なサーマルサイクラーが使用されます。

定量的リアルタイム PCR ( QRT-PCR ) は、単にリアルタイム PCR ( RT-PCR ) と呼ばれることもあり、Sybr Green などの蛍光染料、またはTaqManなどの蛍光体を含む DNA プローブを使用して、増幅の進行中に増幅産物の量をリアルタイムで測定する一連の方法を指します。

ホットスタートPCRは、ポリメラーゼを加える前に反応成分をDNA融解温度（例：95℃）まで加熱することによって手動で行われる技術である。この方法では、低温での非特異的増幅が防止される。^{[6]あるいは、特殊な試薬は、}抗体 の結合、または高温活性化ステップの後にのみ解離する共有結合阻害剤の存在によって、室温でのポリメラーゼの活性を阻害する。「ホットスタート/コールドフィニッシュPCR」は、室温では不活性で、高温でのみ活性化される新しいハイブリッドポリメラーゼによって実現される。

タッチダウンPCRでは、アニーリング温度は後半のサイクルで徐々に低下します。初期のサイクルのアニーリング温度は通常、使用するプライマーの標準T _{mより3～5℃高くなりますが、後半のサイクルではT m}より同程度低くなります。初期のアニーリング温度が高いほどプライマー結合の特異性が高くなり、温度が低いほど反応終了時に増幅効率が高まります。^[7]

アセンブリPCR （ポリメラーゼサイクリングアセンブリまたはPCAとも呼ばれる）は、短い重複セグメントを持つ長いオリゴヌクレオチドのプールに対してPCRを実行し、2つ以上のDNA断片を1つの断片に組み立てることによって長いDNA構造を合成する。これは、重複するプライマーを使用した最初のPCRと、最終的な全長産物を生成するテンプレートとして産物を使用する2番目のPCRを含む。この技術は、ライゲーションベースのアセンブリの代替となる可能性がある。 ^[8]

コロニーPCRでは、細菌コロニーをPCRで直接スクリーニングし、例えば正しいDNAベクター構造をスクリーニングします。コロニーは滅菌ピペットチップでサンプリングされ、少量の細胞がPCRミックスに移されます。細胞からDNAを放出するために、PCRは95℃で長時間（標準ポリメラーゼを使用する場合）で開始するか、100℃で短縮された変性ステップと特別なキメラDNAポリメラーゼで開始します。^[9]

デジタルポリメラーゼ連鎖反応は、エマルジョン内の個別の液滴またはマイクロウェル内のパーティション内 の数千のサンプルを同時に増幅します。

自殺PCRは、古遺伝学や、偽陽性を回避し、増幅断片の特異性を確保することが最優先されるその他の研究で一般的に使用されています。この方法は、中世の黒死病の流行中にペストで死亡したとされる14世紀の人々の墓から採取された歯のサンプルに、微生物であるペスト菌が存在するかどうかを確認する研究で最初に説明されました。^[10]この方法では、PCRでプライマーの組み合わせを1回だけ使用することを規定しています（したがって、「自殺」という用語が使用されています）。このプライマーの組み合わせは、陽性対照PCR反応では決して使用すべきではありません。また、プライマーは、このプライマーセットまたは他のプライマーセットを使用してラボで以前に増幅されたことのないゲノム領域を常にターゲットにする必要があります。これにより、以前のPCR反応からの汚染DNAがラボに存在せず、偽陽性を生成する可能性がなくなります。

COLD-PCR (低温PCRでの共増幅)は、野生型と変異を含む DNA サンプルの混合物から変異対立遺伝子を濃縮する改良されたプロトコルです。

基本的な PCR プロセスは、別の手法の前または後に実行される場合があります。

RT-PCR（または逆転写PCR ）は、 RNAをcDNAに逆転写して増幅するために使用されます。PCRの前に、 RNAをcDNAに変換する酵素である逆転写酵素を使用した反応が行われます。2つの反応はチューブ内で組み合わせることができ、PCRの最初の加熱ステップは転写酵素を不活性化するために使用されます。 ^[4] Tthポリメラーゼ（後述）はRT活性を持ち、反応全体を実行できます。RT-PCRは、遺伝子の発現を検出する発現プロファイリングで広く使用されています。また、RNA転写物の配列を取得するためにも使用でき、転写開始部位と終結部位の決定（ RACE-PCRによる）に役立ち、遺伝子配列内のエクソンとイントロンの位置のマッピングを容易にします。

2 テール PCR では、 3' 末端と 5' 末端の両方を持つマイクロ RNA ターゲットに結合する単一のプライマー (ヘミプローブと呼ばれる) を使用します。^[11]結合が起こるためには、両端が相補的でなければなりません。次に、3' 末端は逆転写酵素によって延長され、長い cDNA を形成します。次に、cDNA は 2 つのターゲット特異的 PCR プライマーを使用して増幅されます。どちらも短いマイクロ RNA ターゲットをターゲットとする 2 つのヘミプローブの組み合わせにより、2 テール アッセイは極めて高感度で特異的になります。

ライゲーション媒介PCRでは、まず標的DNAの断片にライゲーションされる小さなDNAオリゴヌクレオチド「リンカー」（またはアダプター）を使用する。次に、リンカー配列にアニールするPCRプライマーを使用して標的断片を増幅する。この方法は、DNAシーケンシング、ゲノムウォーキング、DNAフットプリント法に採用されている。^[12]関連する技術として、ゲノムの診断断片を生成する 増幅断片長多型が ある。

メチル化特異的PCR（MSP ）は、ゲノムDNAのシトシン-グアニン（CpG）アイランドにおけるDNAメチル化パターンを識別するために使用されます。 ^[13]ターゲットDNAは最初に亜硫酸ナトリウムで処理され、メチル化されていないシトシン塩基がPCRプライマーのアデノシンと相補的なウラシルに変換されます。次に、亜硫酸ナトリウム処理されたDNAに対して2つの増幅が行われます。1つのプライマーセットはシトシン（メチル化シトシンに対応）を含むDNAにアニールし、もう1つのセットはウラシル（メチル化されていないシトシンに対応）を含むDNAにアニールします。定量PCRで使用されるMSPは、特定のCpGアイランドのメチル化状態に関する定量的な情報を提供します。^[14]

最適なパフォーマンスを得るために、PCR のコンポーネントの調整が一般的に使用されます。

PCRポリメラーゼ活性には二価マグネシウムイオン（Mg ⁺⁺）が必要である。Mg ^++の濃度が低いと複製の忠実度が上がり、濃度が高いと変異が多くなる。^[15]

変性剤（ DMSOなど）は、非特異的プライマー結合を不安定化させることで増幅特異性を高めることができます。グリセロールなどの他の化学物質は、増幅中のポリメラーゼの活性を 安定させます。界面活性剤（ Triton X-100など）は、ポリメラーゼが自分自身や反応チューブの壁に付着するのを防ぐことができます。

DNA ポリメラーゼは、伸長鎖にミスマッチ塩基を組み込むことがあります。高忠実度 PCR では、このミス組み込み率を下げる3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を使用します。校正活性を持つ酵素の例にはPfuがあります。Mg ⁺⁺と dNTP の濃度を調整することで、元のターゲット DNA と正確に一致する生成物の数を最大化できます。^{[引用が必要]}

PCR のプライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチドの調整は、改変の豊富なソースです。

通常、PCR プライマーはゲノムの不変部分から選択され、それらの間の多型領域を増幅するために使用されることがあります。対立遺伝子特異的 PCRでは、その逆が行われます。少なくとも 1 つのプライマーは、その 3' 末端 (またはその近く) に変異がある多型領域から選択されます。厳しい条件下では、不一致のプライマーは複製を開始しませんが、一致するプライマーは開始します。したがって、増幅産物の出現は遺伝子型を示します。 (詳細については、SNP 遺伝子型判定を参照してください。)

インターシーケンス特異的PCR（またはISSR-PCR）は、ゲノム全体で繰り返されるセグメントから選択されたプライマーを使用して、増幅された産物の長さの固有のフィンガープリントを生成するDNAフィンガープリント法です。 ^[16]一般的に繰り返されるセグメント からのプライマーの使用はAlu-PCRと呼ばれ、これらの繰り返しに隣接する（または繰り返し間の）配列を増幅するのに役立ちます。

プライマーは「縮重」するように設計することもできます。つまり、多数のターゲット位置から複製を開始できます。 全ゲノム増幅( WGA ) は、未知のゲノムの多くの場所で増幅を起こせるようにする一連の手順であり、少量しか利用できない場合があります。他の技術では、特定の位置で複数のヌクレオチドを使用して合成される縮重プライマーを使用します(ポリメラーゼが正しく一致するプライマーを「選択」します)。また、プライマーは、通常の 4 つの塩基のうち 3 つにハイブリダイズするヌクレオシド類似体の イノシンを使用して合成できます。同様の技術により、PCR で部位特異的突然変異誘発を実行できます。 (オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応も参照)

通常、PCR で使用されるプライマーは、ターゲットに対して完全に相補的となるように設計されます。ただし、ポリメラーゼは 3' 末端から離れたミスマッチを許容します。 テールプライマーには、5' 末端に非相補的配列が含まれます。一般的な手順は、リンカープライマーの使用です。これにより、PCR 産物の末端に制限部位が最終的に配置され、後でクローニングベクターに挿入しやすくなります。

「コロニーPCR」法（上記）の拡張として、ベクタープライマーを使用する方法があります。まず、標的DNA断片（またはcDNA）をクローニングベクターに挿入し、挿入部位に隣接するベクター領域用にプライマーセットを1つ設計します。挿入されたDNAが何であれ、増幅が起こります。^[4]

PCR は、簡単に変更して、後でハイブリダイゼーションプローブとして使用するためのラベル付き製品を生成することができます。 PCR では、1 つまたは両方のプライマーを放射性または蛍光ラベルがすでに付加された状態で使用することも、増幅後にラベルを追加することもできます。 これらのラベル付け方法は、「非対称 PCR」(上記) と組み合わせて、効果的なハイブリダイゼーション プローブを生成することができます。

RNase H依存性PCR（rhPCR）はプライマーダイマーの形成を減らし、マルチプレックスPCRにおけるアッセイ数を増やすことができる。この方法では、耐熱性RNase HII酵素の作用によって除去される3'末端の切断可能なブロックを持つプライマーを使用する。 ^[17]

PCR で使用される DNA ポリメラーゼはいくつかあります。

クレノウ断片は、大腸菌由来のDNA ポリメラーゼ Iから派生したもので、PCR で最初に使用された酵素です。高温では安定性がないため、サイクルごとに補充する必要があり、PCR ではあまり使用されません。

バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ（ファミリーA）も当初はPCRに使用されていました。これはクレノウ断片よりも複製の忠実度が高いですが、熱によって破壊されます。T7 DNAポリメラーゼ（ファミリーB）は同様の特性と目的を持っています。これは部位特異的変異誘発^[18]やサンガー配列決定に応用されています。^[19]

Taqポリメラーゼは、 Thermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼIで、PCRで使用された最初の耐熱性ポリメラーゼであり、現在でも最も一般的に使用されている。この酵素は、天然源から単離することも、大腸菌で発現させたクローン遺伝子から単離することもできる。 ^[4] 5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠く61kDaの断片は、ストッフェル断片として知られ、大腸菌で発現される。 ^[20]エキソヌクレアーゼ活性が欠如しているため、天然酵素よりも長い標的を増幅できる可能性がある。AmpliTaqおよびKlentaqとして商品化されている。 ^[21]ホットスタートPCR用に設計された「Faststartポリメラーゼ」と呼ばれる変異体も生産されている。これは強力な熱活性化を必要とするため、低温でのポリメラーゼ活性による非特異的増幅を回避できる。他にも多くの変異体が作られている。 ^[22]

サーマス・サーモフィラス由来のTthポリメラーゼI（P52028）などの他のサーマスポリメラーゼも、いくつかの用途に使用されています。TthはMn2 ⁺イオンの存在下で逆転写酵素活性を持ち、RNA標的からのPCR増幅を可能にします。^[23]

始生代ピロコッカス属は、校正活性を持つ耐熱性ポリメラーゼの豊富な供給源であることが証明されている。ピロコッカス・フリオサスから単離されたPfu DNAポリメラーゼは、 Taqと比較して複製エラー率が5倍減少している。^[24] PCRが進むにつれてエラーが増加するため、産物を個別にクローニングして配列決定または発現させる場合は、Pfuポリメラーゼが好まれる。この属のその他のあまり使用されていないポリメラーゼには、ピロコッカス・ウォエセイ由来のPwo（P61876）、無名の種由来のPfx 、 GB-D株由来の「ディープベント」ポリメラーゼ（Q51334 ）などがある。 ^[25]

VentまたはTliポリメ​​ラーゼは、 Thermococcus litoralisから単離された極めて耐熱性の高いDNAポリメラーゼである。Thermococcus fumicolans（Tfu ）由来のポリメラーゼも商品化されている。^[25]

場合によっては、PCR の基本的なメカニズムさえも変更されることがあります。

通常のPCRとは異なり、逆PCRでは既知の配列を囲むDNAの増幅と配列決定が可能です。まず標的DNAを一連の制限酵素 消化にかけ、次に得られた断片を自己連結によって環状化します。プライマーは既知のセグメントから外側に伸びるように設計されており、その結果、環状の残りの部分が増幅されます。これは、さまざまなゲノムインサートの両側の配列を識別するのに特に役立ちます。^[26]

同様に、熱非対称インターレースPCR（TAIL-PCR）は、ゲノムの既知の領域に隣接する未知の配列を分離するために使用されます。既知の配列内では、TAIL-PCRは異なるアニーリング温度を持つネストされたプライマーペアを使用します。「縮重」プライマーは、未知の配列から反対方向に増幅するために使用されます。^[27]

PCRの代わりに使用できるDNA増幅プロトコルがいくつか開発されている。これらは等温であり、一定の温度で実行されることを意味する。^[28]

ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）は従来のPCRに似ていますが、変性とアニーリング/伸長のステップを繰り返すのではなく、一定の温度を使用します。DNAヘリカーゼはDNAをほどく酵素であり、熱変性の代わりに使用されます。 ^[29] ループ介在等温増幅は同様のアイデアですが、鎖置換ポリメラーゼを使用して行われます。 ^[30]

ニッキング酵素増幅反応（NEAR）とその類似の鎖置換増幅反応（SDA）は等温反応であり、ポリメラーゼとニッキング酵素を使用して一定温度でDNAを複製する。 ^[28]

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA） ^[31]は、リコンビナーゼを使用して、相同性に基づいてプライマーを二本鎖DNAと特異的にペアリングし、サンプル中に存在する特定のDNA配列からのDNA合成を誘導します。標的配列の存在によりDNA増幅が開始され、DNAの熱または化学的な溶解は必要ありません。反応は急速に進行し、通常5〜10分以内に、わずか数個の標的コピーから検出可能なレベルまで特異的DNA増幅をもたらします。反応システム全体は乾燥製剤として安定しており、冷蔵する必要はありません。RPAは、さまざまな実験室アプリケーションでPCRの代わりに使用でき、ユーザーは独自のアッセイを設計できます。 ^[32]

等温増幅の他のタイプには、全ゲノム増幅（WGA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、転写介在増幅（TMA）などがある。^[28]

• ベクターレットPCR

• PCR アプリケーション マニュアル (Roche Diagnostics 社製)。
• qPCR のリファレンス - 学術および産業情報プラットフォーム
• www.eConferences.de ストリーミング ポータル - qPCR、dPCR、NGS に関する知識を広げましょう。