T7 DNAポリメラーゼ

DNA指向性DNAポリメラーゼ
図 1. T7 DNA複製複合体の結晶構造。PDB 1T7P からレンダリング。
識別子
生物	腸内細菌ファージT7
シンボル	5
CAS番号	9012-90-2
ユニプロット	P00581
その他のデータ
EC番号	2.7.7.7
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T7 DNAポリメラーゼは、 T7バクテリオファージのDNA複製中に使用される酵素です。このプロセス中、DNAポリメラーゼは既存のDNA鎖を「読み取り」、既存のものと一致する2つの新しい鎖を作成します。T7 DNAポリメラーゼは、その機能を果たすために、宿主因子である大腸菌チオレドキシン^[1]を必要とします。これにより、必要なタンパク質とプライマーテンプレートの結合が安定化し、処理能力が100倍以上向上します。これは、この酵素に特有の機能です。^{[2]これは、}大腸菌DNAポリメラーゼIやTaq DNAポリメラーゼを含むファミリーA DNAポリメラーゼのメンバーです。

このポリメラーゼは、部位特異的変異誘発^[3]やPCRに適した高忠実度酵素など、さまざまな用途に使用されています。^[4]また、 DNAシークエンシングに最適化された人工酵素であるSequenase ^[5]の前身としても機能しています。^[6]

図2. DNAポリメラーゼによるヌクレオチド転移。

T7 DNAポリメラーゼは、 T7ファージのDNA複製中にリン酸基転移^{[7]を触媒する。}図2に示すように、プライマーの3'ヒドロキシル基は求核剤として作用し、ヌクレオシド5'-三リン酸（dTMP-PP）のリン酸ジエステル結合を攻撃する。この反応により、DNAにヌクレオシド一リン酸が付加され、ピロリン酸（PPi）が放出される。一般に、この反応は金属依存性であり、酵素活性部位にはMg ²⁺などの陽イオンが存在することが多い。 ^[7]

T7 DNAポリメラーゼの場合、指、手のひら、親指（図1）でプライマーテンプレートを配置し、プライマー鎖の3'末端がヌクレオチド結合部位（指と親指の交差点にある）の隣に位置します。^[8]ヌクレオチドとテンプレート塩基の間に形成された塩基対は、指とプライマーの3'末端の間の溝にぴったり収まります。^[8] 2つのMg ^{2+イオンは酸素}リガンドと八面体配位ネットワークを形成し、反応性プライマーヒドロキシルとヌクレオチドαリン酸を近づけることで、求核付加のエントロピーコストを下げます。^[8]触媒サイクルの律速段階は、ヌクレオシド三リン酸が結合した後、DNAに組み込まれる前に発生します（DNAとヌクレオチドの周りの指サブドメインが閉じることに対応）。^[8]

活性部位に存在するアミノ酸は、反応が進行するための安定した環境を作り出すのに役立ちます。Lys522 、Tyr526、His506、Arg518などのアミノ酸は、水素結合供与体として機能します。Ala476 、Asp475、Asp654の骨格カルボニルは、 Mg ^{2+イオンと}配位結合を形成します。

^{Asp475とAsp654はMg 2+}カチオンとブリッジを形成し、それらを適切に配向します。右側のMg ^{2+イオン（}図3）は、アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）リン酸の負に帯電した酸素と相互作用して、プライマーが攻撃するための切断可能な結合を整列させます。 ^[8]プライマーヒドロキシルを脱プロトン化する一般的な塩基が活性部位内に存在しない場合でも、金属結合ヒドロキシルの低下したpkaにより、3'-水酸化物求核剤の形成が促進されます。 ^[8]金属イオンとLys522は、αリン酸上の非架橋酸素と接触して、求核剤との結合形成中にαリン上に発生する負電荷を安定化します。

さらに、Lys522側鎖も負に帯電したピロリン酸基を中和するように動きます。Tyr526、His506、Arg518側鎖とAla476の骨格カルボニル基の酸素は水素結合ネットワークに参加し、リン酸基転移のための基質の整列を助けます。^[8]

T7 ファージは高等生物と非常によく似た方法でDNA 複製を媒介しますが、T7 システムは他の複製システムに比べて一般的に単純です。T7 DNA ポリメラーゼ(gp5 とも呼ばれます)に加えて、T7レプリソームが適切に機能するために必要なのは、宿主チオレドキシン、gp4、gp2.5、gp1.7 の 4 つの補助タンパク質だけです。

T7 ポリメラーゼ自体のプロセッシビティは非常に低い。約 15 ヌクレオチドを取り込んだ後、プライマーテンプレートから解離する。宿主に感染すると、T7 ポリメラーゼは宿主のチオレドキシンに1:1 の比率で結合する。チオレドキシンと T7 ポリメラーゼの疎水性相互作用は、T7 ポリメラーゼのプライマーテンプレートへの結合を安定化させるのに役立つ。さらに、チオレドキシンの結合により、T7 ポリメラーゼのプロセッシビティは 80 倍近くまで増加する。^[9]チオレドキシン-T7 ポリメラーゼ複合体がどのようにしてこのようなプロセッシビティの向上を達成できるかの正確なメカニズムはまだわかっていない。チオレドキシンの結合により、T7 ポリメラーゼの親指領域にある多数の塩基性アミノ酸残基が露出する。いくつかの研究は、これらの正に帯電した塩基性残基と、 DNAおよびその他の補助タンパク質の負に帯電したリン酸骨格との間の静電相互作用が、gp5/チオレドキシン複合体のプロセッシビティの向上の原因であることを示唆している。^{[9] [10] [11]}

gp4 は、ヘリカーゼドメインとプライマーゼドメインという2 つの機能ドメインを含む 6 量体タンパク質です。ヘリカーゼドメインは、複製のためのテンプレートを提供するために二本鎖 DNA をほどきます。ヘリカーゼドメインのC 末端には、T7 ポリメラーゼ/チオレドキシンの露出した塩基性残基と接触する、負に帯電した酸性残基がいくつか含まれています。これらの相互作用は、T7 ポリメラーゼ/チオレドキシン複合体を複製フォークにロードするのに役立ちます。プライマーゼドメインは、短いオリゴリボヌクレオチドの合成を触媒します。プライマーと呼ばれるこれらのオリゴリボヌクレオチドは、テンプレート鎖と相補的であり、DNA 複製を開始するために使用されます。T7 システムでは、1 つのサブユニットのプライマーゼドメインが隣接するサブユニットのプライマーゼドメインと相互作用します。プライマーゼドメイン間のこの相互作用は、必要に応じてヘリカーゼを停止するブレーキとして機能し、後続のスタンド合成に合わせて先行スタンド合成が行われるようにします。^[11]

gp2.5は一本鎖DNA結合タンパク質と同様の機能を持っています。gp2.5は複製中に生成される一本鎖DNAを保護し、酸性C末端テールとgp5/チオレドキシンとの相互作用を通じてリーディング鎖とラギング鎖の合成を調整します。^[11]

gp1.7はヌクレオシド一リン酸キナーゼであり、デオキシヌクレオシド5'-一リン酸を二リン酸および三リン酸ヌクレオチドに変換する反応を触媒し、T7ポリメラーゼのジデオキシヌクレオチドに対する感受性の原因となっている（下記のSequenaseを参照）。^[11]

T7 DNA ポリメラーゼの主要 gp5 サブユニットは、それ自体ではプロセッシビティが低く、わずか数ヌクレオチドを取り込んだだけで DNA から解離します。効率的にプロセッシブになるために、T7 DNA ポリメラーゼは宿主チオレドキシンをリクルートしてチオレドキシン-gp5 複合体を形成します。チオレドキシンは gp5 のチオレドキシン結合ドメインに結合し、gp5 の柔軟な DNA 結合領域を安定化します。gp5 のこの領域が安定化すると、プライマーテンプレートの二重鎖部分とタンパク質表面の相互作用の量がアロステリックに増加します。結果として生じるチオレドキシン-gp5 複合体は、プライマー末端に対する T7 ポリメラーゼの親和性を約 80 倍に増加させ、約 800 ヌクレオチドの取り込みステップでプロセッシブに作用します。^[12]

T7 ポリメラーゼがプロセッシビティを達成するために採用するメカニズムは、DNA クランプやクランプ ローダーに依存しない点で、他の多くのポリメラーゼとは異なります。代わりに、T7 DNA ポリメラーゼ複合体は、プロセッシブ DNA 重合に、T7 ポリメラーゼ (gp5)、大腸菌チオレドキシン、および一本鎖 DNA 結合タンパク質 gp2.5 の 3 つのタンパク質のみを必要とします。^[13]テンプレート一本鎖 DNA 重合に必要なのはこれら 3 つのタンパク質のみですが、ネイティブの生物学的設定では、チオレドキシン gp5 は一本鎖 DNA テンプレートを提供する gp4 ヘリカーゼと相互作用します (図 4)。リーディング ストランド合成中、チオレドキシン gp5 と gp4 は高親和性複合体を形成し、ポリメラーゼ全体のプロセッシビティを約 5 kb に増加させます。^{[14] [15]}

T7 DNAポリメラーゼは、3'-5'一本鎖および二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性を有する。このエキソヌクレアーゼ活性は、新しく合成された塩基がテンプレート鎖と正しく塩基対を形成しない場合に活性化される。誤って組み込まれた塩基の除去は校正機構として機能し、それによってT7ポリメラーゼの忠実度を高める。^[4] エキソヌクレアーゼ活性の初期の特性評価中に、T7ポリメラーゼの鉄触媒酸化により、エキソヌクレアーゼ活性が大幅に低下した改変酵素が生成されることが判明した。この発見により、T7ポリメラーゼが初期のDNAシーケンシング法におけるシーケンサーとして開発され、使用されるようになった。^[16]

T7 DNAポリメラーゼがミスマッチ塩基が組み込まれたことを感知するメカニズムは、まだ研究中です。しかし、いくつかの研究では、塩基対ミスマッチによって引き起こされるテンプレートDNA鎖の張力の変化がエキソヌクレアーゼの活性化を引き起こす可能性があることを示唆する証拠が示されています。Wuiteらは、テンプレートDNAに40 pNを超える張力を加えると、エキソヌクレアーゼの活性が100倍に増加することを観察しました。^[17]

部位特異的突然変異誘発は、遺伝子および遺伝子産物のDNA 配列に特定の意図的な変更を加えるために使用される分子生物学的手法です。この技術は、オリゴヌクレオチドを完全な相補 DNA 鎖に変換するための最高品質の市販 DNA ポリメラーゼが大腸菌 DNA ポリメラーゼ 1 の大きな (クレノウ) フラグメントであった時代に開発されました。しかし、オリゴヌクレオチド突然変異誘発では、ライゲーション ステップが問題になることがあります。つまり、DNA リガーゼが DNA ポリメラーゼに比べて効率的に動作しない場合、オリゴヌクレオチドの鎖置換によって突然変異頻度が低下する可能性があります。一方、T7 DNA ポリメラーゼは鎖置換合成を行わないため、ライゲーションとは無関係に点突然変異の高い突然変異頻度を得るために使用できます。^[18]

cDNA クローニングは、ゲノムの発現を分析するための主要な技術です。全長の第 1 鎖は、市販の逆転写酵素を使用して合成できます。第 2 鎖の合成は、かつて cDNA クローニングの大きな制約でした。第 2 鎖を合成するために、開始メカニズムが異なる 2 つのグループの方法が開発されました。第 1 グループの方法では、第 2 鎖の合成は第 1 鎖の配列内で開始されます。ただし、第 1 鎖の 3' 末端の消化が必要なため、mRNA の 5' 末端に対応する配列が失われます。第 2 グループの方法では、第 2 鎖の合成は第 1 鎖の配列の外で開始されます。このグループの方法では、第 1 鎖の 3' 末端の消化は必要ありません。ただし、このグループの方法の制約は伸長にあります。 T7 DNAポリメラーゼによるクローニングは、第2鎖合成反応中にポリ(dT)領域を消化できるようにすることで、この制限を克服するのに役立ちます。したがって、ターミナルトランスフェラーゼで合成された領域のサイズは、所定のサイズ範囲内である必要はなく、結果として得られるクローンには限られたサイズの領域が含まれます。さらに、T7 DNAポリメラーゼの3'エキソヌクレアーゼ活性が高いため、完全長の第2鎖を高収率で得ることができます。^[19]

サンガー配列決定において、DNAポリメラーゼに関する大きな問題の1つは、連鎖終結ヌクレオチドであるジデオキシヌクレオチドに対する識別です。既知のDNAポリメラーゼのほとんどはddNTPに対して強く識別するため、効率的な連鎖終結にはdNTPに対するddNTPの比率を高くする必要があります。T7 DNAポリメラーゼはddNTPに対して数倍しか識別しないため、ゲル上のDNAバンドの均一性を高めるのに必要なddNTPの濃度ははるかに低くなります。しかし、その強力な3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は配列決定を妨害する可能性があります。dNTPの濃度が低下するとエキソヌクレアーゼ活性が増加し、結果としてDNAの合成または分解が正味でなくなるためです。DNA配列決定に使用するために、T7 DNAポリメラーゼは化学的に（Sequenase 1.0）または残基の削除によって（Sequenase Version 2.0）エキソヌクレアーゼ活性を除去するように改変されています。^{[4] [20]}