デジタルポリメラーゼ連鎖反応

デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルPCR、デジタルPCR、dPCR、またはdePCR）は、従来のポリメラーゼ連鎖反応法をバイオテクノロジーで改良したもので、 DNA、cDNA、またはRNAを含む核酸鎖を直接定量化し、クローン増幅するために使用できます。 dPCRとqPCRの主な違いは核酸の量を測定する方法にあり、前者はPCRよりも正確な方法ですが、経験の浅いユーザーが行うとエラーが発生しやすくなります。^[1] PCRは1つのサンプルにつき1つの反応を実行します。 dPCRもサンプル内で1つの反応を実行しますが、サンプルは多数のパーティションに分割され、反応は各パーティションで個別に実行されます。この分離により、より信頼性の高い収集と核酸量の高感度測定が可能になります。この方法は、コピー数変異や点突然変異などの遺伝子配列の変異の研究に有用であることが実証されています。

ポリメラーゼ連鎖反応法は、核酸分子を酵素DNA ポリメラーゼで増幅することにより核酸を定量するために使用されます。^[2]従来のPCR は、増幅が指数関数的であるという理論に基づいています。したがって、核酸は、増幅サイクル数と PCR 最終産物の量を参照サンプルと比較することによって定量化できます。^[3]ただし、多くの要因によりこの計算が複雑になり、不確実性や不正確さが生じます。これらの要因には、初期の増幅サイクルが指数関数的ではない可能性があること、PCR 増幅が不確かなサイクル数の後に最終的にプラトーになること、および標的核酸分子の初期濃度が低いと検出可能なレベルまで増幅されない可能性があることが含まれます。ただし、PCR の最も重要な制限は、対象サンプルの PCR 増幅効率が参照サンプルの効率と異なる可能性があることです。

dPCRでは、ウェルごとに1つの反応を実行する代わりに、PCR溶液を数万個のナノリットルサイズの液滴に分割し、各液滴で別々のPCR反応が行われます。^{[4] [5]} PCR溶液はTaqManアッセイと同様に作成され、テンプレートDNA（またはRNA）、蛍光クエンチャープローブ、プライマー、およびPCRマスターミックスで構成され、DNAポリメラーゼ、dNTP、MgCl ₂、および反応バッファーが最適な濃度で含まれています。サンプルを分割するには、マイクロウェルプレート、キャピラリー、オイルエマルジョン、核酸結合表面を備えた小型チャンバーのアレイなど、いくつかの異なる方法を使用できます。^[6] PCR溶液は、それぞれが増幅に必要な成分を含む小さなユニットに分割されます。次に、分割されたユニットをサーモサイクリングにかけ、各ユニットが独立してPCR増幅を受けることができるようにします。複数のPCR増幅サイクルの後、サンプルは「0」または「1」のバイナリ読み取り値で蛍光がチェックされます。蛍光を発する液滴の割合が記録される。^[5]サンプルを分割することで、分子集団がポアソン分布に従うと仮定して異なる分子の数を推定することができ、1つの液滴に複数の標的分子が存在する可能性を考慮することができる。ポアソンの小数の法則を使用すると、サンプル内の標的分子の分布を正確に近似することができ、PCR産物の標的鎖を定量化することができる。^[7]このモデルは、少なくとも1つの標的分子を含むサンプルの数が増えると、サンプルに複数の標的分子が含まれる確率が高くなることを単純に予測している。^[8]従来のPCRでは、PCR増幅サイクルの数は開始コピー数に比例する。dPCRは絶対定量を提供するという多くの人々の考えとは異なり、デジタルPCRは統計的検出力を使用して相対定量を提供する。たとえば、サンプルAを100万の分割で分析したときに1つの陽性反応が得られたとしても、サンプルAに開始分子が1つあることを意味するわけではない。^[要出典]

dPCRの利点には、大量のサンプルを分割することで精度が向上することがあり、再現性により目的のDNA配列の信頼性の高い測定が保証されます。^[5]基本的なPCRで小さな変化の違いを検出する場合、エラー率は大きくなりますが、dPCRではDNA配列で検出できる小さな変化の違いによりエラー率は小さくなります。この技術自体が必要な試薬の量を減らすため、必然的に実験コストが下がります。また、dPCRは、増幅されたターゲットDNAの量を決定するために溶液の相対的な蛍光に依存しないため、定量性が非常に高くなります。

dPCR は、各分子が 1 つの液滴に含まれているため、実際の分子数 (ターゲット DNA) を測定するため、離散的な「デジタル」測定になります。dPCR はサンプルの陽性率、つまり適切な増幅により蛍光を発している液滴の数を測定するため、絶対的な定量化が実現します。この陽性率は、テンプレート核酸の初期量を正確に示します。同様に、qPCR は蛍光を利用しますが、特定の時間 (通常は各増幅サイクル後) に蛍光の強度を測定してターゲット分子 (DNA) の相対量を決定しますが、定義された標準の異なる量を使用して標準曲線を作成しない限り、正確な量を特定することはできません。サイクルあたりのしきい値 (CT) を示し、CT の差を使用して初期核酸の量を計算します。したがって、qPCR はアナログ測定であり、測定に必要な外挿のためにそれほど正確ではない可能性があります。^{[6] [9]}

dPCR は、増幅が完了した後の DNA の量を測定し、次に反復の割合を決定します。これは、実験が完了した後にデータを観察する必要があるため、エンドポイント測定の代表例です。対照的に、qPCR は、増幅プロセス中の特定のポイントで DNA の相対的な蛍光を記録するため、実験プロセスを停止する必要があります。qPCR のこの「リアルタイム」の側面は、理論的には実験の停止により結果に影響を与える可能性があります。^{[引用が必要]}ただし、実際には、ほとんどの qPCRサーマルサイクラーは、次の融解ステップに進む前に、アニーリング/伸長ステップの最後に各サンプルの蛍光を非常に迅速に読み取ります。つまり、この仮説的な懸念は、大多数の研究者にとって実際には関連がなく、適用できません。dPCR は、エンドポイント PCR サイクリングの生成物を測定することによって増幅を測定するため、PCR 阻害剤の存在やプライマーテンプレートの不一致による増幅効率の低下から生じるアーティファクトの影響を受けにくくなります。^{[10] [11]}

リアルタイムデジタルPCR（rdPCR）は、デジタルPCR（dPCR）と定量PCR（qPCR）の手法を組み合わせ、dPCRの精度とqPCRのリアルタイム分析機能を統合します。この統合により、感度、特異性、核酸配列の絶対定量能力が向上し、科学研究や臨床研究における遺伝物質の定量化に貢献します。^{[12] [13]}

qPCRは、遺伝子発現の違いや2倍未満のコピー数変異を区別することができません。一方、dPCRは精度が高く、遺伝子発現の30％未満の差異を検出し、1コピーのみ異なるコピー数変異を区別し、0.1％未満の頻度で発生する対立遺伝子を識別できることが示されています。^{[14] [5]}

デジタルPCRは、基礎研究、臨床診断、環境検査において多くの用途がある。その用途には、病原体の検出や消化器系の健康分析、^{[15] [16]} がんモニタリングのための液体生検、臓器移植拒絶反応モニタリング、重篤な遺伝子異常の非侵襲的出生前検査、^{[17] [18] [19] [20 ] [ 21] [22] [23] [24]}コピー数多型解析、^{[25] [26] [27]}単一遺伝子発現解析、^[28]稀少配列検出、^{[24] [29] [30]}遺伝子発現プロファイリングおよび単一細胞解析などがある。^{[31] [32] [30] [33] [34] [35] [36]}バイオプロセスにおけるDNA汚染物質の検出、 ^[37]遺伝子編集の検証および癌のバイオマーカーとしてのDNAの特定のメチル化変化の検出、^{[38] [39] [40]}細菌集団におけるプラスミドコピー数の決定など。^{[41] dPCRは、}次世代シーケンシング（NGS）で検出されたまれな変異を確認したり、NGSライブラリを検証したりするための直交法としても頻繁に使用されています。^{[42] [43] [44]}

dPCRは、標的核酸を単一分子の解像度で絶対的かつ再現性のある定量化を可能にする。^{[30] [45] [46] [47]}しかし、アナログ定量PCR （qPCR）とは異なり、dPCRによる絶対定量化には標準曲線が必要ない。^[45]また、dPCRはqPCRと比較して阻害物質や増幅効率の悪いPCRアッセイに対する耐性が高い。^{[48] [11]}

dPCRは、例えば、食品中の汚染された遺伝子組み換え生物の特定の配列の存在、 ^[49]血液中のウイルス量、^[50] PBMC、^{[51] [52]}血清サンプル、^[53]絨毛膜絨毛組織、^{[51] [52]}脳脊髄液中の神経変性疾患のバイオマーカー、^[54]飲料水中の糞便汚染を定量化することができます。^[55]

単一コピーの参照遺伝子座に対するコピー数状態の変化は、それが生殖細胞に現れる場合は「コピー数多型」（CNV）、体細胞に現れる場合はコピー数変化（CNA）と呼ばれます。 ^[56] CNVまたはCNAは、細胞内に存在する参照遺伝子座のコピー数に関する遺伝子座の欠失または増幅に起因する可能性があり、これらを合わせると、ヒトゲノムの変動の主な原因となります。 [ ^{57] [58] [59]これらは、がん、 [60] [61] [62]}神経系、^[63]精神科、 [ ^{64] [65]}自己免疫疾患、^[66]薬物有害反応と関連付けられています。^[67]ただし、qPCRなどの他の方法を使用してこれらの対立遺伝子変異を高精度で測定することは困難であるため、変化したCNV状態と表現型および疾患の関連を困難にしています。^{[68] [69]}

サンプル分割によって可能になった多数の「デジタル化された」エンドポイント測定により、dPCRは、SNPベースのマイクロアレイ^[70]やqPCR[71]などの他の方法と比較して、コピー数の小さな違いをより高い精度と精密さで解決することができます。qPCR^{は、クローン}病、HIV-1感染症、肥満など、いくつかの疾患における遺伝子増幅を正確に定量化する能力に限界があります。^{[73] [69] [72]}

dPCR は、サンプルの単位体積あたりの核酸ターゲットのコピー数を測定するために設計されました。パーティションの約 10% 未満に目的のターゲットが含まれる希薄反応 (「限界希釈」と呼ばれる) で操作する場合、ターゲット CNV から発生する蛍光液滴の数と、不変の単一コピー参照遺伝子座から発生する蛍光液滴の数を比較することで、コピー数を推定できます。^[25]実際、これらの低いターゲット濃度と、同じターゲットの複数のコピーが単一のパーティションに共存する可能性がある高いターゲット濃度の両方で、ポアソン統計を使用してこれらの複数の占有を補正し、各ターゲットの濃度のより正確な値を取得します。^{[74] [6]}

デジタルPCRは、ヒト間の遺伝子コピー数の生殖細胞系列および体細胞系列の変異を明らかにするために使用されてきました^{[75] 。また、} HER2（ERBB2）の増幅と乳がんの進行との関連を研究するためにも使用されています。^{[76] [77] [78] [27]}

デジタルPCRにおけるパーティショニングは感度を高め、標的バイオマーカーの信号を潜在的に競合する背景から分離または大幅に減少させることで、特に一塩基変異（SNV）などの稀なイベントの検出を可能にします。^{[9] [6]}これらのイベントは、稀な変異の検出と稀な配列の検出の2つのクラスに分類できます。

稀な突然変異の検出は、バイオマーカーが、単一ヌクレオチド変異（SNV）のみが異なる非常に豊富な対応物の背景内に存在する場合に発生します。デジタルPCRは、野生型の背景の200,000倍の過剰量が存在する場合でも変異DNAを検出できることが示されており、これは従来のqPCRで達成できる感度の2,000倍です。^[9]

デジタルPCRは、HIV患者のHIV DNA ^[24]や、水質評価のための海洋やその他の水サンプル中の糞便細菌のDNAなどの希少な配列を検出することができます。 ^[79] dPCRは、1,250,000個の細胞に1個という希少な配列を検出できます。^[24]

dPCRの稀な変異を検出する能力は、体液を介して疾患を検出および監視するための一般に非侵襲的な戦略である液体生検の使用を通じて、臨床で特に有益である可能性がある。 ^{[17] [80]}研究者は、血液、尿、脳脊髄液など、患者のさまざまな生物学的液体中の循環腫瘍DNA （ctDNA）の稀な変異を測定することにより、液体生検を使用して癌患者の腫瘍量、治療への反応、および疾患の進行を監視している。^{[17] [81] [82] ctDNA（分子}再発の場合など）の早期検出は、治療を変更する前に臨床再発を待つのではなく、患者の変異シグネチャーに固有の免疫療法または標的療法のより早い投与につながる可能性があり、治療の有効性の可能性を高める可能性がある。液体生検では、組織ベースのテストでは2〜4週間以上かかるのに対し、ターンアラウンドタイムは数日である。^{[83] [84]この結果までの時間の短縮は、医師が}生検データに合わせた治療を迅速化するために利用されている。^[83]

2016年にダナファーバー癌研究所で行われたdPCRを用いた前向き試験では、非小細胞肺癌患者の予測診断ツールとしての液体生検の臨床的有用性が実証されました。^[85]液体生検検査の応用は、乳癌^[86] 、大腸癌^[87]、[88] 、婦人科癌^[89]、膀胱癌^{[81] [90]}の患者においても、疾患負荷と治療に対する腫瘍の反応の両方をモニタリングするために研究されてきました。

遺伝子発現とRNA定量研究は、dPCRの精度と絶対定量の向上の恩恵を受けています。^{[91] RNA定量は}RT-PCRによって達成することができ、RNAは分割反応自体でcDNAに逆転写され、各転写産物（または対立遺伝子転写産物）に由来するRNA分子の数はdPCRによって定量されます。^[31]

RNA分子の定量にはqPCRよりもdPCRを使用した方が感度と精度が向上することが多い。これは定量に標準曲線を使用する必要がないためである。^[92]また、dPCRはRNAの定量においてqPCRよりもPCR阻害剤に対して耐性がある。^{[48] [16] [91]}

dPCRは、蛍光振幅の違いに基づいて標的を区別したり、検出に特徴的な色の組み合わせを使用したりすることで、qPCRよりも検出チャネルごとにより多くの個々の標的種を検出および定量化できます。^{[93] [91]}この例として、2チャネルdPCRシステムを使用して、健康な細胞よりもほとんどの腫瘍細胞でより活性の高いタンパク質であるヒトテロメラーゼ逆転写酵素の4つの異なるスプライスバリアントの発現を1つのウェルで検出しました。 ^[94]

dPCR で採用されている動的パーティショニング機能を使用すると、増幅前に複雑な PCR 反応をパーティショニングして、NGS解析用の多くの異なるアンプリコンにわたってより均一な増幅を実現することで、NGS シーケンシングを改善できます。 ^{[95] [96]さらに、液滴内の複雑な PCR 増幅反応の特異性の向上により、} SELEX法で高親和性アプタマーを選択するために必要な反復回数が大幅に減少することが示されています。 ^[97]パーティショニングにより、細胞溶解物からのテロメラーゼ活性のより堅牢な測定も可能になります。^{[98] [99] dPCR の動的パーティショニング機能を使用して、数千の核または細胞全体を個々の液滴に分割し、}シーケンシング (scATAC-seq) を使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ用のライブラリ準備を容易にすることもできます 。^[100]

ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）は、アッセイプライマーとTaqmanプローブまたはインターカレーション色素を含む20マイクロリットルのサンプル反応を水油エマルジョン技術によって約20,000ナノリットルサイズの油滴に分割し、96ウェルPCRプレートでエンドポイントまで熱サイクルし、ドロップレットフローサイトメーターで各サンプルウェルのすべての液滴の蛍光振幅を読み取るdPCR法です。^[101]

チップベースデジタルPCR（dPCR）もdPCR法の一種で、反応混合物（qPCRで使用される場合も）をチップ上で約10,000〜約45,000のパーティションに分割し、エンドポイントPCRサーモサイクリングマシンを使用して増幅し、各チップ上のすべてのパーティションを蛍光フィルター（HEX、FAM、Cy5、Cy5.5、Texas Red）を備えた高性能カメラリーダーを使用して読み取ります。^[102]

dPCRは、研究者らがβグロビン遺伝子の単一コピーをPCRで検出し増幅できることを示した1988年にCetus Corporationによって初めて発表されたアプローチから生まれました。 ^{[103] [104]}これは、正常なヒト細胞株のDNAサンプルを、βグロビン遺伝子のホモ接合欠失を持つ変異株のDNAで希釈し、反応中にβグロビン遺伝子が存在しなくなるまで希釈することで実現しました。1989年、Peter Simmonds、AJ Brownらがこの概念を使用して初めて分子を定量しました。^[105] Alex MorleyとPamela Sykesは、1992年にこの方法を定量技術として正式に確立しました。^[46]

1999年、バート・フォーゲルシュタインとケネス・キンツラーは「デジタルPCR」という用語を作り出し、この技術がまれな癌の変異を見つけるのに使えることを示しました。^[106]しかし、dPCRは実行が難しく、労働集約的で、適切に行うには多くの訓練が必要で、大量に行うことは困難でした。^{[106] 2003年、キンツラーとフォーゲルシュタインはdPCRの改良を続け、ビーズ、エマルジョン、増幅、磁気の頭文字をとって}BEAMing技術と呼ぶ改良法を生み出しました。新しいプロトコルでは、エマルジョンを使用して増幅反応を1本のチューブに区画化しました。この変更により、科学者は1回の実行で数千の反応にこの方法を拡張することが可能になりました。^{[107] [108] [109]}

市販のdPCRシステムを開発している企業は、サンプルの自動分割、核酸ターゲットのデジタルカウント、液滴数の増加などの技術を統合しており、プロセスの効率化に役立ちます。^{[110] [111] [112]}近年、科学者は非小細胞肺がんやダウン症候群など、いくつかの病状に対するdPCRベースの診断法を開発し、商品化しています。^{[113] [114]}臨床使用のための最初のdPCRシステムは、慢性骨髄性白血病の診断用に2017年にCEマークを取得し、2019年に米国食品医薬品局の承認を受けました。^[115]