多重変位増幅

多重置換増幅（MDA）は、 DNA増幅技術です。この方法は、微量のDNAサンプルをゲノム解析に適した量まで迅速に増幅することができます。反応は、ランダムヘキサマープライマーをテンプレートにアニーリングすることから始まります。DNA合成は、高忠実度酵素、好ましくはΦ29 DNAポリメラーゼによって行われます。従来のPCR増幅技術と比較して、MDAは配列特異的プライマーを使用せず、すべてのDNAを増幅し、エラー頻度の低いより大きなサイズの産物を生成し、一定温度で機能します。MDAは全ゲノム増幅（WGA）で積極的に使用されており、単一細胞ゲノムシーケンシングやシーケンシングベースの遺伝学研究への応用に有望な方法です。

遺伝子分析を伴う多くの生物学および法医学的ケースでは、培養されていない単一細胞からの DNA や犯罪現場から採取された微量の組織など、微量のサンプルからの DNA の配列決定が必要です。従来のポリメラーゼ連鎖反応 ( PCR ) ベースの DNA 増幅法では、配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーと耐熱性 (通常はTaq )ポリメラーゼが必要であり、微量の DNA から大量の DNA を生成するために使用できます。ただし、これは配列決定ベースの DNA 分析を使用する最新の技術には不十分です。したがって、特に単一細胞ゲノム研究では、微量の DNA を増幅するためのより効率的な非配列特異的な方法が必要です。

バクテリオファージΦ29 DNA ポリメラーゼは、 70 キロベースペアを超える DNA アンプリコンを生成できる高処理酵素です。 ^[1]その高い忠実性と 3'-5' 校正活性により、従来のTaqポリメラーゼの報告されたエラー率が 9,000 分の 1 であるのに対し、増幅エラー率は 10 ⁶ −10 ⁷塩基分の 1 に減少します。 ^[2]反応は 30 °C の中程度の等温条件で実行できるため、サーモサイクラーは必要ありません。細胞培養やDNA 抽出を行わずにin vitro でDNA を増幅する酵素法である無細胞クローニングで積極的に使用されています。Bst DNA ポリメラーゼの大きな断片も MDA で使用されますが、十分な生成物収量と校正活性のため、一般的には Ф29 が好まれます。^[3]

ヘキサマープライマーは、6 つのランダムヌクレオチドからなる配列です。MDA アプリケーションでは、これらのプライマーは通常、3' 末端がチオリン酸修飾されており、Ф29 DNAポリメラーゼの 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性をもたらします。MDA 反応は、このようなプライマーが DNA テンプレートにアニーリングすることから始まり、その後ポリメラーゼによる鎖伸長が起こります。増幅反応に伴って、プライマーのアニーリング イベントの数が増加します。

増幅反応は、複数のプライマーヘキサマーがテンプレートにアニールすると開始します。DNA 合成が次の開始部位に進むと、ポリメラーゼは新しく生成された DNA 鎖を置き換え、鎖の伸長を続けます。鎖の置き換えにより、より多くのプライマーがアニールするための新しく合成された一本鎖 DNA テンプレートが生成されます。新しく合成されたテンプレート上でのさらなるプライマーのアニールと鎖の置き換えにより、高分岐 DNA ネットワークが生成されます。増幅中の配列の分岐解除により、生成物の収率が高くなります。DNA 分岐ネットワークを分離するために、S1 ヌクレアーゼを使用して、置き換え部位で断片を切断します。結果として生じた DNA 断片の切れ目は、DNA ポリメラーゼ Iによって修復されます。

MDAは単一細胞から1～2μgのDNAを生成し、ゲノムカバー率は最大99%です。^{[4]また、PCRベースの}Taq増幅に比べてエラー率が低く、サイズも大きくなります。 ^{[4] [5]}

MDAの一般的なワークフロー: ^[6]

1. サンプルの準備: サンプルを収集し、適切な反応バッファー(Ca ²⁺および Mg ^{2+を含まない)で希釈します。細胞は}アルカリ バッファーで溶解します。
2. 条件: Ф29ポリメラーゼによるMDA反応は30℃で行われます。反応には通常約2.5～3時間かかります。
3. 反応終了: 増幅されたDNA産物を収集する前に、65℃で酵素を不活性化する
4. DNA 製品は市販の精製キットで精製できます。

MDA は十分な量の DNA 産物を生成します。これは、培養されていない微生物や単一細胞などのサンプルから DNA 分子を増幅して、配列決定研究に十分な量にする強力なツールです。MDA 増幅 DNA 産物のサイズが大きいため、多型反復対立遺伝子のサイズを識別するのに望ましいサンプル品質も得られます。また、忠実度が高いため、一塩基多型(SNP) 対立遺伝子検出に使用するのにも信頼性があります。増幅中に鎖が置換されるため、増幅された DNA はソース DNA 分子を十分にカバーし、ゲノム分析に使用できる高品質の産物が得られます。置換された鎖の産物は、その後ベクターにクローニングして、後続の配列決定反応用のライブラリを構築できます。

ADO は、ヘテロ接合性サンプルに存在する対立遺伝子の 1 つがランダムに増幅されないことと定義されます。いくつかの研究では、MDA 産物の ADO 率は 0～60% であると報告されています。^{[7]この欠点により、単一サンプルの}遺伝子型判定 の精度が低下し、MDA が関係する他のアプリケーションで誤診が発生する可能性があります。ADO は断片のサイズとは無関係であるように思われ、他の単一細胞技術でも同様の率が報告されています。培養細胞からのPCRによる増幅では ADO 率が低いことが報告されているため、考えられる解決策としては、異なる溶解条件を使用するか、希釈した MDA 産物から複数回の増幅を実行することが挙げられます。

「優先増幅」とは、一方の対立遺伝子が他方の対立遺伝子に比べて過剰に増幅されることです。MDA に関するほとんどの研究でこの問題が報告されています。増幅バイアスは現在ランダムであることが観察されています。これは、ショート タンデム リピート (STR) 対立遺伝子を識別する際のゲノム DNA の小さな範囲の分析に影響を与える可能性があります。

内因性のテンプレートに依存しないプライマー間相互作用は、ヘキサマープライマーのランダムな設計によるものです。 考えられる解決策の 1 つは、クロスハイブリダイズしない制約付きランダム化ヘキサヌクレオチドプライマーを設計することです。

培養されていない細菌、古細菌、原生生物の単一細胞、個々のウイルス粒子、単一真菌 胞子がMDAの助けを借りて配列決定されている。^{[8] [9 ] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]}

個々の細胞を配列する能力は、人間の病気と闘う上でも有用である。MDAを用いた配列決定のために、単一のヒト胚細胞からのゲノムを増幅することに成功し、着床前遺伝子診断（PGD）が可能になった。着床前の初期段階の胚における遺伝的健康問題のスクリーニングである。^[19]癌などの異質な特性 を持つ疾患も、MDAベースのゲノム配列決定による個々の細胞の変異の研究の恩恵を受けている。

単一細胞からの MDA 産物は、通常比較的大量の増幅 DNA を必要とする アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション実験にも効果的に使用されています。

クロマチン免疫沈降法では、比較的短いDNA断片の複雑な混合物が生成され、断片の表現に偏りを生じさせずにMDAで増幅することが困難です。この問題を回避する方法として、ライゲーションを使用してこれらの混合物を環状コンカテマーに変換し、その後Φ29 DNAポリメラーゼを介したMDAを行う方法が提案されています。^[20]

犯罪現場から採取された微量のサンプルは、MDA によって、被害者や容疑者の身元確認に一般的に使用される法医学的 DNA 分析に十分な量まで増幅することができます。

• ポリメラーゼ連鎖反応
• 全ゲノム増幅