ベクトレットPCR

ベクトレットPCRは、1988年に設計されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の変種です。^{[ 1 ]}オリジナルのPCRは1980年代に開発され、特許も取得されました。^{[ 2 ]}ベクトレットPCRは、1990年にジョン・H・ライリーとそのチームによって初めて論文で紹介され、説明されました。^{[ 3 ]}それ以来、PCRの複数の変種が開発されています。ベクトレットPCRは、断片の末端まで既知の内部配列から得られた特定の配列を増幅することに重点を置いています。^{[ 4 ]}多くの研究者が、この方法をベクトレットPCRから得られる潜在的な用途を明らかにするための実験を行う機会として利用してきました。^{[ 1 ]}

ベクターレットPCRはPCRに似ていますが、既知のプライマー部位から増幅に必要な配列を取得できる点が異なります。^{[ 5 ]} PCRは両端の既知の配列情報が必要ですが、ベクターレットPCRは片方の配列情報のみが必要です。^{[ 1 ]}これは、両端の配列情報が必要なPCR法を、片方の端にのみ配列情報があり、もう片方の端にはないDNA断片に適用できることを意味します。 ^{[ 6 ] [ 7 ]}これを実現するには、この方法が最初に経なければならない特定のステップがあります。これらのステップは、ベクターレットPCRの科学的用途と適用方法を発見する目的で研究されてきました。^{[ 1 ]}

ベクターレットPCRは、一方向性のPCR増幅を実現する戦略を開発できます。^{[ 8 ]}ベクターレットPCRは、主に3つのステップから構成されます。^{[ 1 ]}最初のステップでは、制限酵素を使用してサンプルDNAを消化します。^{[ 1 ] [ 6 ]}調査目的で使用されるDNAは、その遺伝子に適した制限酵素によって消化される必要があります。そうでないと、全体集団を構成するDNA断片を作成することができません。^{[ 9 ]}これが完了すると、ベクターレットユニットを、以前に消化された適切なDNA断片に連結することによって、ベクターレットライブラリーが構築されます。 ^{[ 1 ] [ 6 ]}連結とは、2つのものを結合する行為です。^{[ 10 ]}ベクターレットユニットは、完全には二本鎖ではなく、部分的に二本鎖であり、ユニットの中央にミスマッチセクションがあります。^{[ 11 ]}ミスマッチになっている理由は、ベクターレットプライマーが第一鎖合成を起こそうとするのを防ぐためです。こうすることで、非特異的なプライミングも回避されます。^{[ 11 ]}このライゲーションにより、二本鎖のベクトレットと、最初のステップで作成された制限断片の末端が結合します。^{[ 12 ]}こうすることで、一方の側でPCR反応のプライミングに使用される既知の配列が導入され、もう一方の側は、ユーザーにすでに知られているゲノム配列でプライミングされます。^{[ 12 ]} 3番目で最後のステップは2つの部分から構成されています。これは、開始プライマー（IP）とベクトレットプライマー（VP）という2つのプライマーがあり、それぞれ異なる段階で作用するためです。最初の部分では、IPがプライマー伸長の増幅に作用し、VPは産物とハイブリダイズしたままです。したがって、この段階ではバックグラウンド増幅は行われません。しかし、PCRの最後の部分とそれに続く部分では、IPとVPの両方からプライミングが行われるため、状況が変わります。^{[ 6 ]}

ベクターレットPCRとその生物学分野における応用については、多くの研究が行われてきました。科学者たちはベクターレットPCRを用いて、トランスジーンに隣接するDNAを取り出し、分離しました。彼らは、トランスジーン領域の隣にあるマウスのDNAにこの技術を適用しました。この結果から、ベクターレットの使用は複雑なゲノムにおける配列の回収とマッピングを容易にすることができることが示されました。また、ベクターレットPCRは、大きなサイズのPCR産物を扱う場合にサブベクター化によって配列の解析に役立つことも発見されました。^{[ 5 ]}

他の研究では、ゲノムウォーキングを実現するためにVectorette PCRを用いた方法の開発が検討されている。Vectorette PCRを用いることで、科学者たちはPCR産物から得られた一本鎖DNAを取得し、それをシーケンスすることができた。このことから、これまで特徴付けられていなかった配列の増幅が可能なアプローチが特定された。この研究は、既知のDNA配列のみを起点として、いかにして新しい配列を迅速に開発できるかを示している。^{[ 6 ]}

さらなる研究では、マイクロサテライト反復配列の分離を促進する方法の開発が試みられてきました。Vectorette PCR を使用することで、研究者らは新しいマイクロサテライト反復配列でこれを実現する迅速な技術を発見しました。彼らはこの技術を使用して 6 つのマイクロサテライト反復配列を分離することに成功しました。^{[ 13 ]}

ベクトレットPCRは、挿入配列（IS）のゲノム上の位置を特定するだけでなく、それらをマッピングするためにも使用されています。この研究により、微生物株のタイピングを完了する方法や、微生物ゲノムに存在するIS挿入部位などの特定とマッピングが明らかになりました。ベクトレットPCRは、ゲノムのIS要素を迅速かつ簡単に調査する際に有用であることが証明されています。^{[ 14 ]}

転移因子、トランスポゾン、またはTEは、「ジャンプ」と呼ばれるプロセスによってゲノム内の位置を変えることができる遺伝因子の変異体です。^{[ 15 ]} TEディスプレイは、TE挿入部位のさまざまな変異体を提示するように設計されており、多数の優性マーカーの作成に役立ちます。^{[ 16 ]}元の方法で発生した問題は、ゲノム内のトランスポゾンの出力において特異的かつ効率的なPCR法を見つけることでした。^{[ 16 ]}研究者は、PCR法としてVectorette PCRを使用することでこの問題の解決策を見つけました。Vectorette PCRは遺伝子の分離と増幅において特異的であるため、これは彼らの研究に役立ち、時間とコストの両方を節約することでTEディスプレイ法の改善に役立ちました。^{[ 16 ]}その後、研究者は、非放射性のTEディスプレイに基づくVectorette PCRを使用して多数の優性マーカーを作成することができました。^{[ 16 ]}

甲状腺リンパ腫は、甲状腺に属するリンパ球が癌細胞に変化する病気です。 ^{[ 17 ]}研究者らは、この病気の診断に役立つ新しい方法をテストしました。Vectorette PCRの使用を制限酵素消化と組み合わせたところ、Vectorette PCRが研究で有用であることが証明され、甲状腺リンパ腫の診断に役立つことがわかりました。^{[ 18 ]}

研究者らは、疾患遺伝子の検査におけるVectorette PCRの潜在的な使用について調査した。彼らは、転写領域を標的とするために特異的に使用されるトリヌクレオチド反復法とVectorette PCRという2つの方法を用いて、単純反復配列（SSR）を取得した。^{[ 19 ]}これらのSSRから遺伝子マーカーを作成できると考えられている。この研究の結果は、未知のゲノムから輸送可能な遺伝子マーカーの導出を試みる研究者を支援することが期待されている。Vectorette PCRは、検査対象としたトリヌクレオチド反復配列を挟むSSRを明らかにするために使用された。^{[ 19 ]}これはTNRまたはトリヌクレオチドVectorette PCRとしても知られている。彼らは、TNR法と​​Vectorette PCRによる増幅を組み合わせることで、真核生物において単純反復配列に基づく分子マーカーを作成できると考えている。研究者らはまた、この方法が疾患を引き起こす遺伝子を分離しようとする際に有用であると考えている。^{[ 19 ]}

ベクターPCRから派生した用途は多岐にわたり、生物学の分野で役立っています。例えば、類似または近縁の病原体のサブタイプ分類を容易にすることで、疾病発生時に役立つ方法を生み出しています。 ^{[ 14 ]}また、特定の疾患の診断にも使用できます。^{[ 18 ]}このページの前半で述べたように、ベクターPCRは、既知の配列の近くにある新規DNA配列に対して実行できる複数の機能を生み出すことができます。DNAの分離、増幅、分析などのこれらの機能は、ベクターPCRの用途の根底にあります。^{[ 1 ]}これらの用途には、ゲノムウォーキング、酵母人工染色体（YAC）およびコスミド挿入物の末端のDNAシーケンス、ゲノムDNA中のイントロンおよびプロモーターおよび変異領域のマッピング、大型クローンのシーケンスの促進、ゲノムマッピング中に発生するギャップの埋め合わせなどがある。^{[ 1 ]}

イントロンは、エクソンに挟まれたDNA配列であり、エクソンの間に位置します。^{[ 20 ]}これはエクソンが発現する際に切り取られる領域であり、そのためイントロンはアミノ酸コードに影響を与えません。遺伝子発現は、ごく一部のイントロン配列によってのみ影響を受ける可能性があります。^{[ 20 ]}ベクターレットPCRは、これらのイントロン配列が既知の配列の隣にある場合、その特徴付けに有効であることがわかっています。^{[ 21 ]}

cDNA（相補的DNA）は、逆転写酵素プロセス中にDNAを合成する際の鋳型となるRNAに相補的なDNA配列である。^{[ 22 ]} cDNA由来のプライマーを利用するベクトレットPCRは、エクソンに隣接するイントロン配列を取得し、遺伝子の構造の解明に役立つ方法を生み出す。^{[ 23 ]}この方法は、cDNA配列とゲノムのクローンを用いてプロセスを開始することで実現できる。^{[ 23 ]}

ベクトレットPCRは、他の既存の技術を使用する場合よりもユーザーに有利な点も提供します。ユーザーは、無細胞遺伝子操作、最小限の材料で開始するベクトレットPCR、高純度である必要のないDNAを用いたベクトレットPCRなどのタスクを実行できます。これらの利点により、ユーザーは時間とリソースを節約しながら、ターゲットにできるDNAの範囲を広げることができます。^{[ 1 ]}