NASBA（分子生物学）

核酸配列に基づく増幅法（NASBAとも呼ばれる）は、分子生物学において一本鎖RNAの複数のコピーを生成するために使用される手法である。^[1] NASBAは、RNAを取り、特別に設計されたプライマーをアニールし、次に酵素カクテルを使用してRNAを増幅する2段階のプロセスである。^[2]

核酸増幅は、RNA/DNAの特定のセグメントのコピーを複数作成するために使用される技術です。^[3]増幅されたRNAとDNAは、ジェノタイピング、配列決定、細菌やウイルスの検出など、さまざまな用途に使用できます。^[4]増幅には、非等温と等温の2種類があります。^[5]非等温増幅では、異なる温度間の反復サイクルを通じてRNA/DNAの複数のコピーが作成されます。^[6]等温増幅では、一定の反応温度でRNA/DNAの複数のコピーが作成されます。^[7] NASBAは、一本鎖RNAを取り、65°Cでプライマーをアニールし、次に41°Cで増幅して一本鎖RNAの複数のコピーを作成します。^[8]増幅を成功させるために、鳥類骨髄芽球症逆​​転写酵素（AMV-RT）、RNase H、およびRNAポリメラーゼを含む酵素カクテルが使用されます。^[9] AMV-RTはプライマーがアニールされるとRNAテンプレートから相補DNA鎖（cDNA）を合成します。^[10]次にRNase HがRNAテンプレートを分解し、もう一方のプライマーがcDNAに結合して二本鎖DNAを形成し、RNAポリメラーゼがRNAのコピーを合成するために使用します。^[11] NASBAの重要な点の1つは、出発物質と最終産物が常に一本鎖RNAであることです。そうは言っても、DNAの増幅に使用できますが、増幅が成功するためにはDNAをRNAに変換する必要があります。

ループ介在等温増幅(LAMP) は別の等温増幅技術です。

NASBA は 1991 年に J Compton によって開発され、彼はこれを「単一混合物中の核酸を 1 つの温度で連続的に増幅するために使用できるプライマー依存技術」と定義しました。^[12] NASBA の発明直後、NASBA は患者の血清中の HIV-1 の迅速な診断と定量化に使用されました。^{[13] RNA は}逆転写酵素を使用してPCRで増幅することもできますが(相補的な DNA 鎖をテンプレートとして合成するため)、NASBA の主な利点は等温条件下で機能することです。通常、使用されるプライマーと酵素に応じて、41 °C の一定温度または 2 つの異なる温度で機能します。2 つの異なる温度が適用された場合でも、それらの温度間を循環しないため、等温と見なされます。NASBA は、状況によってはより迅速で感度の高い PCR の代替として医療診断に使用できます。^[14]

簡単に説明すると、NASBA は次のように機能します。

1. RNA テンプレートを反応混合物に加えると、5' 末端に T7 プロモーター領域を持つ最初のプライマーがテンプレートの 3' 末端の相補部位に結合します。
2. 逆転写酵素はプライマーの 3' 末端を延長し、RNA テンプレートに沿って上流に向かって移動する反対の相補 DNA鎖を合成します。
3. RNase H はDNA-RNA 化合物から RNA テンプレートを破壊します (RNase H は RNA-DNA ハイブリッド内の RNA のみを破壊し、一本鎖 RNA は破壊しません)。
4. 2 番目のプライマーは (アンチセンス) DNA 鎖の 5' 末端に結合します。
5. 逆転写酵素は、付加されたプライマーから別の DNA 鎖を再び合成し、二本鎖 DNA を生成します。
6. T7 RNAポリメラーゼは二本鎖のプロモーター領域に結合します。T7 RNAポリメラーゼは3'から5'方向にしか転写できないため^[15]、センスDNAが転写され、アンチセンスRNAが生成されます。これが繰り返され、ポリメラーゼはこのテンプレートの相補的なRNA鎖を継続的に生成し、増幅を引き起こします。
7. ここで、前のステップと同様に、循環段階が始まります。ただし、ここでは、2番目のプライマーが最初に(-)RNAに結合します。
8. 逆転写酵素は (+)cDNA/(-)RNA 二重鎖を生成します。
9. RNAse Hは再びRNAを分解し、最初のプライマーは今や一本鎖になった+(cDNA)に結合する。
10. 逆転写酵素は相補的な（-）DNAを生成し、dsDNA二重鎖を形成する。
11. ステップ 6 とまったく同じように、T7 ポリメラーゼがプロモーター領域に結合して (-)RNA を生成し、サイクルが完了します。

NASBA技術は、インフルエンザA、^[16]、 ジカウイルス、口蹄疫ウイルス、^[17]、 重症急性呼吸器症候群（ SARS ）関連コロナウイルス、^[18]、ヒトボカウイルス（HBoV）^[19]、トリパノソーマ・ブルーセイのような寄生虫など、一本鎖RNAゲノムを持ついくつかの病原性ウイルスの迅速診断検査の開発に使用されてきました。^[20]

最近、蛍光、ディップスティック、次世代シーケンシング読み出しを備えたNASBA反応がCOVID-19診断用に開発されました。^[21]

• リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応