CpG サイト

CpGサイトまたはCG サイトは、 5' → 3' 方向に沿った塩基の線形配列でシトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続くDNA領域です。CpG サイトは、CpG アイランドと呼ばれるゲノム領域に高頻度で発生します。

CpGジヌクレオチドのシトシンはメチル化されて5-メチルシトシンを形成する。メチル基を付加する酵素はDNAメチルトランスフェラーゼと呼ばれる。哺乳類では、CpGシトシンの70%～80%がメチル化されている。^{[1]遺伝子内のシトシンをメチル化すると遺伝子の発現が変化する可能性があり、これは}エピジェネティクスと呼ばれる遺伝子調節を研究する科学のより広い分野の一部である。メチル化されたシトシンは多くの場合チミンに変異する。

ヒトでは、遺伝子の転写開始部位の近くに位置するプロモーター（近位プロモーター）の約70％にCpGアイランドが含まれています。 ^{[2] [3]}

CpGは5'-C-リン酸-G-3'の省略形で、シトシンとグアニンが 1 つのリン酸基で区切られていることを意味します。リン酸は DNA 内の任意の2 つのヌクレオシドを結び付けます。CpG表記は、この一本鎖線状配列を、二本鎖配列のシトシンとグアニンのCG塩基対と区別するために使用されます。したがって、CpG 表記は、シトシンがグアニン塩基の5 番目にあると解釈されます。CpGをGpCと混同しないでください。後者は、一本鎖配列の 5' → 3' 方向でグアニンの後にシトシンが続くことを意味します。

CpGジヌクレオチドは、脊椎動物のゲノム配列において、偶然の産物として予想されるよりもはるかに低い頻度で出現することが長い間観察されてきました。例えば、GC含有量が42%のヒトゲノムでは、^[4]シトシンとグアニンからなるヌクレオチドのペアが出現することが予想されます。ヒトゲノムにおけるCpGジヌクレオチドの出現頻度は、予想される頻度の5分の1未満です。^[5]${\displaystyle 0.21\times 0.21=4.41\%}$

この過小表現は、メチル化された CpG 部位の突然変異率が高いことに起因しています。メチル化されたシトシンの自発的な脱アミノ化によりチミンが生成され、その結果生じる G:T ミスマッチ塩基は不適切に A:T に解決されることがよくあります。一方、メチル化されていないシトシンの脱アミノ化によりウラシルが生成されますが、これは外来塩基であるため、塩基除去修復機構によってすぐにシトシンに置き換えられます。メチル化された CpG 部位での C から T への遷移率は、メチル化されていない部位よりも約 10 倍高くなっています。^{[6] [7] [8] [9]}

CpG ジヌクレオチドは CpG アイランドによく見られます (CpG アイランドの定義については下記を参照)。ヒトゲノムには 28,890 個の CpG アイランドがあります (繰り返し配列に CpG アイランドを含めると 50,267 個になります)。^{[10]これは、} Venterらが発見した 28,519 個の CpG アイランドと一致しています。^[11] Venter らのゲノム配列には、非常に類似した繰り返し要素の内部と、セントロメア付近の非常に密度の高い繰り返し領域が含まれていなかったためです。^[12] CpG アイランドには複数の CpG ジヌクレオチド配列が含まれているため、ヒトゲノムには 2,000 万個を超える CpG ジヌクレオチドがあると考えられます。

CpGアイランド（またはCGアイランド）は、CpG部位の頻度が高い領域です。CpGアイランドの客観的な定義は限られていますが、通常の正式な定義は、少なくとも200 bp 、GCパーセンテージが50％を超え、観測されたCpG比と期待されるCpG比が60％を超える領域です。「観測されたCpG比と期待されるCpG比」は、観測されたCpGが次のように計算され、期待されるCpGが^[13]または^[14]として導かれます。${\displaystyle ({\text{CpGの数}})}$${\displaystyle ({\text{Cの数}*{\text{Gの数})/{\text{配列の長さ}}}$${\displaystyle (({\text{Cの数}+{\text{Gの数})/2)^{2}/{\text{配列の長さ}}}$

哺乳類ゲノム中の多くの遺伝子は、遺伝子の開始部分に関連するCpGアイランド（プロモーター領域）を持っています^[15]。このため、CpGアイランドの存在は遺伝子の予測と注釈付けに役立てられています。

哺乳類のゲノムでは、CpGアイランドの長さは通常300～3,000塩基対で、哺乳類遺伝子のプロモーターの約40％またはその付近で発見されています。 ^[16]ヒト遺伝子の60％以上とほぼすべてのハウスキーピング遺伝子のプロモーターはCpGアイランドに埋め込まれています。^[17] GC 2ヌクレオチド配列の頻度を考えると、CpGジヌクレオチドの数は予想されるよりもはるかに少ないです。^[14]

2002年の研究では、CpGアイランド予測のルールを改訂し、Aluリピートなどの他のGCに富むゲノム配列を除外しました。ヒト染色体21と22の完全な配列を広範囲に検索した結果、500bpを超えるDNA領域は、GC含有量が55%を超え、観測されたCpG比と予測されたCpG比が65%の場合、遺伝子の5'領域に関連付けられた「真の」CpGアイランドである可能性が高いことがわかりました。^[18]

CpG アイランドは、統計的に予想される CpG ジヌクレオチド含有量 (~4–6%) の少なくとも 60% を特徴としますが、ゲノムの残りの部分の CpG 頻度ははるかに低く (~1%)、CG 抑制と呼ばれる現象です。遺伝子のコーディング領域の CpG サイトとは異なり、ほとんどの場合、プロモーターの CpG アイランドの CpG サイトは、遺伝子が発現してもメチル化されません。この観察から、遺伝子のプロモーターの CpG サイトのメチル化が遺伝子発現を阻害する可能性があるという推測が生まれました。メチル化は、ヒストン修飾とともに、インプリンティングの中心です。^[19]組織間または正常サンプルと癌サンプル間のメチル化の違いのほとんどは、CpG アイランド自体ではなく、CpG アイランドから近い距離 (「CpG アイランドの岸」) で発生します。^[20]

CpGアイランドは、脊椎動物の遺伝子、特にハウスキーピング遺伝子の転写開始部位またはその付近に典型的に存在します。^[14] C（シトシン）塩基の直後にG（グアニン）塩基が続く配列（CpG）は、脊椎動物のDNAではまれです。これは、そのような配列のシトシンがメチル化される傾向があるためです。このメチル化は、新しく合成されたDNA鎖を親鎖と区別するのに役立ち、複製後のDNA校正の最終段階に役立ちます。しかし、時間が経つと、メチル化されたシトシンは、自発的な脱アミノ化によりチミンに変わる傾向があります。ヒトには、T / GミスマッチからTを特異的に置き換える特別な酵素（チミン-DNAグリコシラーゼ、またはTDG）があります。しかし、CpGはまれであるため、理論上、ジヌクレオチドの急速な変異を防ぐのに十分効果的ではないと考えられています。 CpGアイランドの存在は、通常、比較的高いCpG含有量に対する選択力の存在、またはそのゲノム領域におけるメチル化レベルが低いことによるもので、おそらく遺伝子発現の調節と関係していると考えられます。2011年の研究では、ほとんどのCpGアイランドは非選択力の結果であることが示されました。^[21]

ヒトでは、遺伝子の転写開始部位の近くに位置するプロモーター（近位プロモーター）の約70％にCpGアイランドが含まれています。 ^{[2] [3]}

遠位プロモーター要素にもCpGアイランドが含まれることが多い。一例としてDNA修復遺伝子ERCC1があり、CpGアイランドを含む要素はERCC1遺伝子の転写開始部位から約5,400ヌクレオチド上流に位置している。^[22] CpGアイランドは、マイクロRNAなどの機能的非コードRNAのプロモーターにも頻繁に見られる。^[23]

ヒトでは、DNAのメチル化はCpG部位内のシトシン残基のピリミジン環の5位で起こり、5-メチルシトシンが形成される。プロモーターのCpGアイランドにメチル化されたCpG部位が複数存在すると、遺伝子の安定したサイレンシングが起こる。^[24]遺伝子のサイレンシングは他のメカニズムによって開始されることもあるが、プロモーターCpGアイランドのCpG部位のメチル化が続いて遺伝子の安定したサイレンシングが起こることが多い。^[24]

がんでは、遺伝子発現の喪失は、突然変異によるものよりもプロモーターCpGアイランドの過剰メチル化によって約10倍頻繁に起こります。例えば、大腸がんには通常約3〜6個のドライバー突然変異と33〜66個のヒッチハイカーまたはパッセンジャー突然変異があります。^[25]対照的に、結腸腫瘍と隣接する正常に見える結腸粘膜を比較したある研究では、腫瘍では1,734個のCpGアイランドが高度にメチル化されていたのに対し、これらのCpGアイランドは隣接粘膜ではメチル化されていませんでした。^[26] CpGアイランドの半分は、注釈付きタンパク質コード遺伝子のプロモーターにあり、^[26]これは、結腸腫瘍の約867個の遺伝子がCpGアイランドのメチル化により発現を失ったことを示唆しています。別の研究では、6つの大腸がんのゲノム（隣接粘膜と比較）で平均1,549の異なるメチル化領域（高メチル化または低メチル化）が見つかり、そのうち629は遺伝子の既知のプロモーター領域にありました。^[27] 3番目の研究では、大腸がんと隣接粘膜の間で2,000を超える遺伝子のメチル化が異なることがわかりました。遺伝子セットエンリッチメント解析を使用すると、がんでは938の遺伝子セットのうち569が高メチル化され、369が低メチル化されていました。^[28]プロモーター内のCpGアイランドの低メチル化は、影響を受ける遺伝子または遺伝子セットの過剰発現をもたらします。

2012年の研究^[29]では、大腸がんに関連する高メチル化プロモーターを持つ147の特定の遺伝子と、大腸がんにおけるこれらの高メチル化の頻度がリストアップされています。これらの遺伝子のうち少なくとも10個は、大腸がんのほぼ100%で高メチル化プロモーターを持っていました。また、大腸がんの50%から100%の頻度でプロモーターが高メチル化されている11のマイクロRNAも示されています。マイクロRNA（miRNA）は、メッセンジャーRNAの配列と対になって転写後抑制を指示する小さな内因性RNAです。平均して、各マイクロRNAは数百の標的遺伝子を抑制します。^[30]したがって、高メチル化プロモーターを持つマイクロRNAは、がんにおいて数百から数千の遺伝子の過剰発現を可能にしている可能性があります。

上記の情報は、がんにおいて、遺伝子およびマイクロRNAのプロモーターCpGの過剰/低メチル化が、突然変異よりもはるかに多くの遺伝子の発現の喪失（または場合によっては発現の増加）を引き起こすことを示しています。

DNA修復遺伝子は、プロモーター内のCpGアイランドの過剰メチル化のために、癌では頻繁に抑制されます。頭頸部扁平上皮癌では、少なくとも15のDNA修復遺伝子のプロモーターが頻繁に過剰メチル化されています。これらの遺伝子は、XRCC1、MLH3、PMS1、RAD51B、XRCC3、RAD54B、BRCA1、SHFM1、GEN1、FANCE、FAAP20、SPRTN、SETMAR、HUS1、およびPER1です。^[31]約17種類の癌では、プロモーターの過剰メチル化により、1つ以上のDNA修復遺伝子が欠損していることがよくあります。^[32]一例として、DNA修復遺伝子MGMTのプロモーター高メチル化は、膀胱がんの93％、胃がんの88％、甲状腺がんの74％、大腸がんの40％～90％、脳腫瘍の50％で発生します。LIG4のプロモーター高メチル化は、大腸がんの82％で発生します。NEIL1のプロモーター高メチル化は、頭頸部がんの62％、非小細胞肺がんの42％で発生します。ATMのプロモーター高メチル化は、非小細胞肺がんの47％で発生します。MLH1のプロモーター高メチル化は、非小細胞肺がんの扁平上皮がんの48％で発生します。FANCBのプロモーター高メチル化は、頭頸部がんの46％で発生します。

一方、PARP1とFEN1 という2 つの遺伝子のプロモーターは低メチル化されており、これらの遺伝子は多くの癌で過剰発現していました。PARP1とFEN1 は、エラーを起こしやすく突然変異を起こしやすい DNA 修復経路であるマイクロホモロジー媒介末端結合に必須の遺伝子です。この経路が過剰発現すると、過剰な突然変異が癌につながる可能性があります。PARP1はチロシンキナーゼ活性化白血病^[33]、神経芽腫^[34] 、精巣およびその他の生殖細胞腫瘍^[35]、ユーイング肉腫^{[36]で過剰発現しています}。FEN1 は、乳癌^[37]、前立腺癌^[38]、胃癌^{[39] 、 [40]}神経芽腫^[41] 、膵臓癌^[42]、肺癌^[43]の大部分で過剰発現しています。

DNA損傷は癌の主な根本原因であると思われる。^{[44] [45]}正確なDNA修復が不十分な場合、DNA損傷は蓄積する傾向がある。このような過剰なDNA損傷は、エラーを起こしやすいトランスレジョン合成により、DNA複製中に突然変異エラーを増加させる可能性がある。過剰なDNA損傷は、DNA修復中のエラーによるエピジェネティックな変化も増加させる可能性がある。 ^{[46] [47]このような突然変異とエピジェネティックな変化は}癌を引き起こす可能性がある（悪性新生物を参照）。したがって、DNA修復遺伝子のプロモーターにおけるCpGアイランドの過剰/低メチル化は、癌の進行の中心である可能性が高い。

年齢は数万のCpG部位のDNAメチル化レベルに強い影響を及ぼすため、人間とチンパンジーでは非常に正確な生物時計（エピジェネティック時計またはDNAメチル化年齢と呼ばれる）を定義することができます。^[48]

メチル化されていないCpGジヌクレオチド部位は、ヒトの形質細胞様樹状細胞、単球、ナチュラルキラー（NK）細胞、B細胞上のToll様受容体9（ TLR9）^[49]によって検出されます。これは細胞内ウイルス感染を検出するために使用されます。

哺乳類では、DNAメチルトランスフェラーゼ（DNA塩基にメチル基を付加する）はCpG部位内のシトシンに対して優先的な配列を示す。 ^[50]マウスの脳では、全シトシンの4.2%がメチル化されており、主にCpG部位で5mCpGを形成している。^[51]過剰メチル化された5mCpG部位のほとんどは、関連する遺伝子の抑制を増加させる。^[51]

デュークらによるレビューによると、ニューロンDNAメチル化（特定の遺伝子の発現抑制）はニューロン活動によって変化する。ニューロンDNAメチル化はシナプス可塑性に必要であり、経験によって修正され、活性DNAメチル化と脱メチル化は記憶の形成と維持に必要である。^[52]

2016年にHalderら^[53]はマウスを用いて、また2017年にDukeら^[52]はラットを用いて、げっ歯類に文脈恐怖条件付けを施し、特に強力な長期記憶を形成させた。条件付けの24時間後、ラットの海馬脳領域では、1,048個の遺伝子の発現がダウンレギュレーションされ（通常、遺伝子プロモーターの5mCpGに関連）、564個の遺伝子の発現がアップレギュレーションされた（多くの場合、遺伝子プロモーターのCpG部位の低メチル化に関連）。訓練の24時間後、ラットの海馬ニューロンのゲノムにある遺伝子の9.2％が差別的にメチル化されていた。しかし、海馬は新しい情報を学習するために不可欠であるが、それ自体は情報を保存するわけではない。ハルダーのマウス実験では、文脈的恐怖条件付けの 1 時間後に海馬で 1,206 個の異なるメチル化遺伝子が見られましたが、これらの変化したメチル化は元に戻り、4 週間後には見られなくなりました。海馬での長期的な CpG メチル化の変化がないのとは対照的に、記憶維持中の皮質ニューロンでは、かなりの異なる CpG メチル化が検出されました。文脈的恐怖条件付けの 4 週間後に、マウスの前帯状皮質には 1,223 個の異なるメチル化遺伝子がありました。

成体体細胞では、DNAメチル化は典型的にはCpGジヌクレオチド（CpG部位）の文脈で起こり、5-メチルシトシン-pG、または5mCpGを形成する。活性酸素種（ROS）はジヌクレオチド部位のグアニンを攻撃し、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン（8-OHdG）を形成し、5mCp-8-OHdGジヌクレオチド部位をもたらす。塩基除去修復酵素OGG1は8-OHdGを標的とし、即時の除去なしに病変に結合する。5mCp-8-OHdG部位に存在するOGG1はTET1をリクルートし、TET1は8-OHdGに隣接する5mCを酸化する。これにより5mCの脱メチル化が開始される。^[54]

2018年にレビューされたように、^[55]脳ニューロンでは、5mCは10-11転座（TET）ファミリーのジオキシゲナーゼ（TET1、TET2、TET3）によって酸化され、5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）が生成されます。連続したステップで、TET酵素は5hmCをさらに水酸化して、 5-ホルミルシトシン（5fC）と5-カルボキシルシトシン（5caC）を生成します。チミン-DNAグリコシラーゼ（TDG）は中間塩基5fCと5caCを認識し、グリコシド結合を切断してアピリミジン部位（AP部位）を形成します。別の酸化的脱アミノ化経路では、5hmC は活性誘導性シチジン脱アミノ化酵素/アポリポタンパク質 B mRNA 編集複合体(AID/APOBEC)脱アミノ化酵素によって酸化的に脱アミノ化されて 5-ヒドロキシメチルウラシル (5hmU) が形成されるか、または 5mC はチミン(Thy)に変換されます。5hmU は、TDG、一本鎖選択的単機能ウラシル DNA グリコシラーゼ 1 ( SMUG1 )、Nei 様 DNA グリコシラーゼ 1 ( NEIL1 )、またはメチル CpG 結合タンパク質 4 ( MBD4 ) によって切断されます。その後、AP サイトと T:G ミスマッチは塩基除去修復 (BER) 酵素によって修復され、シトシン(Cyt) が生成されます。

2つのレビュー^{[56] [57]は、}記憶形成におけるROSの重要な役割に関する膨大な証拠を要約しています。記憶形成中の何千ものCpG部位のDNA脱メチル化は、ROSによる開始に依存しています。2016年に、Zhouら^{[54]は、ROSが}DNA脱メチル化において中心的な役割を果たしていることを示しました。

TET1は5mCpGの脱メチル化に関与する重要な酵素である。しかし、TET1が5mCpGに作用できるのは、ROSがまずグアニンに作用して8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン（8-OHdG）を形成し、5mCp-8-OHdGジヌクレオチドを生成した場合のみである（このセクションの最初の図を参照）。^[54] 5mCp-8-OHdGの形成後、塩基除去修復酵素OGG1は8-OHdG病変に結合しますが、すぐには除去しません。OGG1が5mCp-8-OHdG部位に付着するとTET1がリクルートされ、このセクションの最初の図に示すように、TET1は8-OHdGに隣接する5mCを酸化できるようになります。これにより、このセクションの2番目の図に示す脱メチル化経路が開始されます。

ニューロンDNA内の遺伝子プロモーターのCpG部位のROS依存性脱メチル化によって制御されるニューロンにおけるタンパク質発現の変化は、記憶形成の中心となる。^[58]

CpG の減少は、転移因子(TE)の DNA メチル化の過程で観察されており、TE はゲノムの拡大だけでなく、宿主 DNA の CpG 損失にも関与しています。TE は「メチル化センター」として知られており、メチル化プロセスでは、TE は宿主 DNA 内で一度、隣接する DNA に広がります。この広がりは、その後、進化の過程で CpG 損失につながる可能性があります。進化の時代が古いほど、隣接する DNA での CpG 損失が大きくなります。したがって、DNA メチル化は、最終的に隣接する DNA の CpG サイトの顕著な損失につながる可能性があります。^[59]

ゲノムサイズとCpGアイランドの数には一般的に逆相関関係があり、ゲノムが大きいほど転移因子の数が多くなります。メチル化によって発現が抑制されると、TEに対する選択圧が大幅に減少し、さらにTEが「メチル化センター」として機能して、隣接するDNAのメチル化を促進します。メチル化はヌクレオチド配列に対する選択圧を低下させるため、CpG部位の長期メチル化は、自発的なシトシンからチミンへの遷移の蓄積を増加させ、その結果、Cp部位が失われます。 ^[59]

Alu要素は最も豊富なタイプの転移要素として知られています。いくつかの研究では、ゲノム拡大の原因となる因子を研究する方法としてAlu要素が使用されています。Alu要素はLINEやERVとは異なり、より長い配列でCpGに富んでいます。Aluはメチル化センターとして機能することができ、宿主DNAへの挿入によりDNAメチル化が生じ、Flanking DNA領域への拡散を誘発します。この拡散により、かなりのCpG損失とゲノム拡大が見られます。^[59]ただし、これは時間の経過とともに分析される結果であり、古いAlu要素は若い要素と比較して、隣接するDNAのサイトでより多くのCpG損失を示しています。

• TLR9、非メチル化CpG部位の検出器
• DNAメチル化年齢