5-ヒドロキシメチルシトシン

5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）は、シトシン由来のDNAピリミジン窒素塩基です。シトシンのヒドロキシメチル基が遺伝子のオン/オフを切り替える可能性があるため、エピジェネティクスにおいて重要な役割を果たす可能性があります。 1952年にバクテリオファージで初めて発見されました。 ^{[ 1 ] [ 2 ]}しかし、2009年にはヒトとマウスの脳^{[ 3 ]} 、および胚性幹細胞^{[ 4 ]}に豊富に存在することが発見されました。哺乳類では、 TET酵素によって媒介される反応である5-メチルシトシンの酸化によって生成されます。

哺乳類のすべての細胞には5-ヒドロキシメチルシトシンが含まれているようですが、そのレベルは細胞の種類によって大きく異なります。最も高いレベルは中枢神経系の神経細胞に見られます。^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]}マウスの海馬と小脳で示されているように、ヒドロキシメチルシトシンの量は加齢とともに増加します。^{[ 5 ] [ 8 ]}

この窒素塩基の正確な機能はまだ完全には解明されていませんが、遺伝子発現を調節したり、DNA脱メチル化を促進したりする可能性があると考えられています。この仮説は、5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）を含む人工DNAが哺乳類細胞に導入されると、修飾されていないシトシンに変換されるという事実によって裏付けられています。^{[ 9 ]}さらに、5hmCは始原生殖細胞に非常に豊富に存在し、そこで全体的なDNA脱メチル化に役割を果たしているようです。^{[ 10 ]}また、5-ヒドロキシメチルシトシンの酸化生成物であり、酸化脱メチル化経路の中間体である可能性のある5-ホルミルシトシンが胚性幹細胞のDNAで検出されましたが、^{[ 11 ]}これらの推定脱メチル化中間体はマウス組織では有意な量で検出されませんでした。^{[ 7 ]} 5-ヒドロキシメチルシトシンは中枢神経系に非常に高濃度で存在するため、特に重要である可能性があります。^{[ 7 ]} 5-ヒドロキシメチルシトシンレベルの低下は、胚性幹細胞の自己複製能の低下と関連していることがわかっています。^{[ 12 ]} 5-ヒドロキシメチルシトシンは、細胞分化中に頻繁に再配置される不安定なヌクレオソームとも関連しています。^{[ 13 ]}

分裂後ニューロンにおける5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）の蓄積は、転写と遺伝子発現を促進する「機能的脱メチル化」と関連している。^{[ 14 ]}ニューロンに適用される「脱メチル化」 という用語は、通常、 TET酵素およびDNA塩基除去修復経路の酵素が関与する一連の反応によって起こり得る、DNA中の5-メチルシトシン（5mC）のシトシンへの置換を指す（学習と記憶におけるエピジェネティクスを参照）。DNA中の5mCの「脱メチル化」は、多くの場合、神経活動を伴う遺伝子の発現促進をもたらす。「機能的脱メチル化」とは、通常、TETを介した単一ステップ反応である5mCの5hmCへの置換を指し、これも遺伝子発現を促進し、「脱メチル化」と同様の効果をもたらす。

5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）レベルの変化は、幅広いヒト疾患に関与しており、がん生物学、診断、神経発達障害において重要な役割が認められている。

ファージは、細菌のほとんどの制限酵素による認識を回避するために5hmCを使用するように進化してきたと考えられます。T4ファージは複製中に5hmCのみを使用し、ヒドロキシル基にグリコシル化を追加して、その部分をさらに複雑にしています。^{[ 25 ]}一方、一部の細菌は、 5hmCを含む部位に特異的な制限酵素を進化させてきました。その代表的な例の1つが、1994年に最初に同定されたPvuRts1Iです。^{[ 26 ]}

T4中の5hmCは、ゲノムタンパク質42、デオキシシチジル酸5-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（P08773；EC 2.1.2.8）によって生成される。グリコシル化反応は、EC 2.4.1.26、EC 2.4.1.27、およびEC 2.4.1.28として知られている。

5-ヒドロキシメチルシトシンは、ハインツ研究室の同僚であるスキルマンタス・クリアウシオニスによって発見されました。彼は2種類のニューロンにおける5-メチルシトシンのレベルを調べていました。代わりに、彼は未知の物質がかなりの量存在することを発見し、いくつかのテストを行った後、それが5-ヒドロキシメチルシトシンであると特定しました。^{[ 27 ]}

L. Aravind の研究室はバイオインフォマティクスツールを使用して、Tet ファミリーの酵素が 5-メチルシトシンを 5-ヒドロキシメチルシトシンに酸化する可能性が高いと予測しました。^{[ 28 ]}これは、Anjana Rao とDavid R. Liuの研究室で働く科学者によって、試験管内および生きたヒトとマウスの細胞で実証されました。

5-ヒドロキシメチルシトシンは、1972年にR. Yuraによって哺乳類で初めて観察されましたが^{[ 29 ]}、この最初の発見は疑わしいものです。Yuraは、ラットの脳と肝臓に5-hmCが極めて高いレベルで存在し、5-メチルシトシンを完全に置き換えていることを発見しました。これは、HeintzとRaoの論文を含む、それ以前およびそれ以降に行われた哺乳類のDNA組成に関するすべての研究と矛盾しており、別のグループはYuraの結果を再現できませんでした^{[ 30 ] 。}

5-ヒドロキシメチルシトシンの発見により、ビスルフィットシーケンス法を用いたDNAメチル化研究に関していくつかの懸念が生じている。^{[ 31 ]}ビスルフィット変換実験では、5-ヒドロキシメチルシトシンは前駆体である5-メチルシトシンと同様の挙動を示すことが示されている。^{[ 32 ]}したがって、検出された修飾塩基が5-メチルシトシンか5-ヒドロキシメチルシトシンかを検証するために、ビスルフィットシーケンスデータを再検討する必要があるかもしれない。2012年、Chuan Heの研究室は、Tetファミリー酵素の酸化特性を利用して、通常のビスルフィット変換実験で5-ヒドロキシメチルシトシンが5-メチルシトシンとして検出される問題を解決する方法を発見した。この方法はTAB-seqと呼ばれている。^{[ 33 ] [ 34 ]}

2020年6月、オックスフォードナノポアは、研究用ベースコーラーであるrerioにヒドロキシメチルシトシン検出モデルを追加し、R9+ナノポアランからの古いシグナルレベルデータを再呼び出しして5hmCを識別できるようにした。^{[ 35 ]}

2024年現在、5-hmCの存在を特徴付ける方法には以下が含まれる：^{[ 36 ]}

• 濃縮法：免疫沈降法（hMeDIP、CMS-DIP）、アフィニティープルダウン法（GLIB、hmC-Seal）、塩基分解能に近いオリゴタグ法（Jump-seq、TOP-seq）、塩基分解能のhmC-CATCH
• シーケンス：
  • ビスルフィド：oxBS-seq、TAB-seq、bACE-seq
  • 非ビスルフィド変換：ACE-seq、CAPS(+)、TAPS/TAPS-β6文字seq、6文字seq
  • 変換不要：SMRT、ナノポア、光マッピング、および単一分子エピジェネティックイメージング

• メチル化