DNAの脱メチル化

哺乳類の分子生物学では、DNA の脱メチル化により、DNA 配列内の5-メチルシトシン(5mC) がシトシン(C)に置き換えられます(5mC と C の図を参照)。DNA の脱メチル化は、DNA 配列内の 5mC の部位で活性プロセスによって発生する場合もあれば、複製細胞で DNA へのメチル基の追加を阻止して、複製された DNA の DNA 配列にシトシンが大部分含まれるようにする (5mC が希釈される) 場合もあります。

メチル化シトシンは、シトシンの後に5' → 3' 方向にグアニンが続く線状DNA 配列( CpG サイト) に頻繁に存在します。哺乳類では、DNA メチルトランスフェラーゼ(DNA 塩基にメチル基を付加する) は、CpG サイトのシトシンに対して強い配列優先性を示します。^[1]ヒトゲノムには 2,000 万を超える CpG ジヌクレオチドがあるようです (ゲノム分布を参照)。哺乳類では、平均して CpG シトシンの 70% ～ 80% がメチル化されていますが^[2]、メチル化のレベルは組織によって異なります。メチル化シトシンは、遺伝子のプロモーター領域内のグループまたはCpG アイランドに発生することが多く、このようなメチル化により遺伝子発現が減少または抑制される可能性があります (遺伝子発現を参照)。ただし、遺伝子本体のメチル化シトシンは発現と正の相関関係にあります。^[3]

ほぼ 100% の DNA 脱メチル化は、初期胚形成および配偶子形成で起こる再プログラミング中に、受動的な希釈と能動的な酵素除去の組み合わせによって発生します。もう 1 つの大きな脱メチル化 (全遺伝子の約 3%) は、強力な記憶の形成中にニューロンで能動的な脱メチル化によって発生する可能性があります。^[4]手術後、末梢血単核細胞で免疫系遺伝子に注釈が付けられた部位に脱メチル化が見られます。^[5]脱メチル化は、がんの形成中にも発生します。 [ ^6]腫瘍ゲノムの全体的な DNA 低メチル化中に、メチル化シトシン (5mC) の数が軽度から中程度に減少し、平均で約 5% から 20% の 5mC 塩基が失われます。^[7]

マウスの精子 ゲノムは、DNAのCpG部位で80～90％がメチル化されており、メチル化部位は約2000万個に上ります。^[要出典]受精後、父方の染色体はDNA複製前の能動的なプロセスによって6時間以内にほぼ完全に脱メチル化されます（図の青線）。

母親のゲノムの脱メチル化は、異なるプロセスによって起こります。成熟した卵母細胞では、DNAのCpG部位の約40%がメチル化されています。哺乳類の体細胞には、CpG部位のシトシンにメチル基を付加する3つの主要なDNAメチルトランスフェラーゼ、DNMT1、DNMT3A、DNMT3Bがありますが、着床前胚から胚盤胞段階まで存在するメチルトランスフェラーゼは、DNMT1のアイソフォームであるDNMT1oのみです。^[8] DNMT1oには、代替の卵母細胞特異的プロモーターと、体細胞プロモーターと精母細胞プロモーターの5'に位置する最初のエクソン（エクソン1o）があります。 Howellら^[8]がレビューしたように、 DNMT1oは成熟卵母細胞の細胞質と2細胞および4細胞胚に隔離されていますが、8細胞期には核にのみ存在します。16細胞期（桑実胚）では、DNMT1oは再び細胞質にのみ存在します。母親の染色体の脱メチル化は、8細胞期の短い期間を除いて、メチル化酵素DNMT1oが核に入るのをブロックすることによって主に起こるようです。したがって、母親由来のDNAは、複製中にメチル化された母親DNAの希釈によって受動的に脱メチル化されます（図の赤線）。桑実胚（ 16細胞期）では、 DNAメチル化はわずかです（図の黒線）。

DNMT3bは胚盤胞で発現し始める。^[9]受精後3.5日目に胚盤胞でのメチル化が増加し始め、4.5日目から5. 5日目に上胚葉でメチル化の大きな波が起こり、メチル化は12%から62%になり、子宮への着床後に最大レベルに達する。^[10]受精後7日目までに、着床した胚内で新しく形成された始原生殖細胞（PGC）は、残りの体細胞から分離する。この時点で、PGCのメチル化レベルは体細胞とほぼ同じである。

着床した胚で新たに形成された始原生殖細胞（PGC）は、体細胞から進化します。この時点で、PGCはメチル化レベルが高くなっています。これらの細胞は、上胚葉から生殖隆起に向かって移動します。Messerschmidtらによるレビューによると、^[11] PGCの大部分は細胞周期のG2期で停止し、胚7.5日目から8.5日目の間に後腸に向かって移動します。その後、PGCの脱メチル化が2つの波で発生します。^[11] 9.5日目に始原生殖細胞は急速に複製を開始し、胚9.5日目のPGC約200個から12.5日目のPGC約10,000個に増加します。^[12] 9.5日目から12.5日目にはDNMT3aとDNMT3bが抑制され、DNMT1は核内に高レベルで存在する。しかし、UHRF1遺伝子（ NP95としても知られる）が抑制されており、UHRF1は維持DNAメチル化が行われる複製フォーカスにDNMT1をリクルートするために必要な必須タンパク質であるため、DNMT1は9.5日目から12.5日目にはシトシンをメチル化することができない。^[12]これは受動的な希釈型の脱メチル化である。

さらに、胚 9.5 日から 13.5 日までは、脱メチル化の活発な形態が見られます。以下の「活発な再プログラミングの分子段階」で示されているように、2 つの酵素が活発な脱メチル化の中心となっています。これらは、10-11 転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ (TET)とチミン DNA グリコシラーゼ(TDG) です。特定の TET 酵素である TET1 と TDG は、胚 9.5 日から 13.5 日まで高レベルで存在し、^[12]配偶子形成中の活発な脱メチル化に使用されます。^[11] PGC ゲノムは、胚 13.5 日目に、マウスの全ライフサイクルのどの細胞よりも DNA メチル化レベルが低い状態を示します。^[13]

学習と記憶には永続性のレベルがあり、思考、言語、意識など、本質的に一時的な他の精神プロセスとは異なります。学習と記憶はゆっくりと蓄積される場合もあれば（掛け算の表）、急速に蓄積される場合もあります（熱いストーブに触れるなど）、一度獲得すると、長期間意識的に思い出すことができます。文脈的恐怖条件付けを一度受けたラットは、特に強力な長期記憶を形成します。訓練後24時間で、ラットの海馬ニューロンのゲノムの遺伝子の9.17％が差別的メチル化されていることがわかりました。これには、訓練後24時間で2,000を超える差別的メチル化遺伝子が含まれ、500を超える遺伝子が脱メチル化されていました。^[4]ラットの海馬での結果と同様の結果は、文脈的恐怖条件付けを受けたマウスでも得られました。^[14]

脳の海馬領域は、文脈的恐怖記憶が最初に保存される場所ですが（このセクションの脳の図を参照）、この保存は一時的で、海馬に残りません。ラットでは、条件付けのわずか1日後に海馬を摘出すると文脈的恐怖条件付けは解除されますが、海馬摘出を4週間遅らせると、ラットはかなりの文脈的恐怖を保持します。^[15]条件付けの4週間後に検査されたマウスでは、海馬のメチル化と脱メチル化が逆転していました（海馬は記憶の形成に必要ですが、記憶はそこに保存されません）が、記憶維持中に皮質ニューロンでかなりの差異的CpGメチル化と脱メチル化が発生しました。文脈的恐怖条件付けの4週間後のマウスの前帯状皮質には、1,223個の差異的メチル化遺伝子がありました。つまり、記憶が形成された直後には海馬に多くのメチル化が存在していたものの、4週間後には海馬のメチル化はすべて脱メチル化されていたのです。

ヒトゲノムには約2800万のCpG部位が含まれており、CpG部位の約60％はシトシンの5位でメチル化されています。^[16]癌の形成中、メチル化されたシトシンの数は平均して約5％から20％減少し、^[17]または約84万から340万のCpG部位の脱メチル化が起こります。

DNMT1 は、DNA 複製中にヘミメチル化 DNA 上の CpG をメチル化します。したがって、DNA 鎖にメチル化 CpG があり、半保存的複製中に新しく複製された鎖に相補的な CpG 上のメチル基がない場合、DNMT1 は通常、ヘミメチル化部位にリクルートされ、新しく合成された CpG のシトシンにメチル基を追加します。ただし、DNA 複製中にヘミメチル化 CpG 部位に DNMT1 がリクルートされるかどうかは、 UHRF1タンパク質に依存します。UHRF1 がヘミメチル化 CpG 部位に結合しない場合、DNMT1 はリクルートされず、新しく合成された CpG 部位をメチル化できません。アルギニン メチルトランスフェラーゼPRMT6 は、ヒストン 3 (H3R2me2a)の位置 2 のアルギニンをメチル化することで DNA のメチル化を制御します。 ^[18]（タンパク質メチル化#アルギニンを参照）H3R2me2aが存在すると、UHRF1はヘミメチル化されたCpG部位に結合できず、DNMT1はその部位にリクルートされず、その部位はヘミメチル化されたままとなる。その後の複製ラウンドで、メチル化されたCpGは受動的に希釈される。PRMT6は多くの種類の癌細胞で頻繁に過剰発現している。^[19] PRMT6の過剰発現は、癌におけるDNA脱メチル化の原因となる可能性がある。

DNA メチロームを能動的に酵素的に再プログラムするには、3 つの分子段階が必要です。第 1 段階: リクルート。再プログラムに必要な酵素は、脱メチル化またはメチル化を必要とするゲノム部位にリクルートされます。第 2 段階: 実行。最初の酵素反応が起こります。メチル化の場合、これはシトシンから 5-メチルシトシンへのメチル化をもたらす短いステップです。第 3 段階: 塩基除去 DNA 修復。脱メチル化の中間生成物は、塩基除去 DNA 修復経路の特定の酵素によって触媒され、最終的に DNA 配列内のシトシンが復元されます。

5-メチルシトシンの脱メチル化による5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）の生成には、多くの場合、最初に5mCの酸化（このセクションの図を参照）が10-11転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ（TET酵素）によって行われます。^{[21]この最初の脱メチル化の分子段階は、} TET酵素に詳細に示されています。次の段階では（図を参照）、TET酵素が5hmCをさらに水酸化して、5-ホルミルシトシン（5fC）と5-カルボキシルシトシン（5caC）を生成します。チミン-DNAグリコシラーゼ（TDG）は、中間塩基5fCと5caCを認識し、グリコシド結合を切除してアピリミジン部位（AP部位）を形成します。その後、塩基除去修復（ステージ3）が行われます。別の酸化的脱アミノ化経路では、5hmCはAPOBEC（AID/APOBEC）デアミナーゼによって酸化的に脱アミノ化され、5-ヒドロキシメチルウラシル（5hmU）が形成される。また、5mCはチミン（Thy）に変換される。5hmUはTDG、 MBD4、NEIL1、またはSMUG1によって切断される。その後、AP部位とT：Gミスマッチは塩基除去修復（BER）酵素によって修復され、シトシン（Cyt）が生成される。最も頻繁に使用される脱メチル化反応には、TETファミリーのジオキシゲナーゼが使用される。^[21]

TETジオキシゲナーゼアイソフォームには、TET1の少なくとも2つのアイソフォーム、TET2の1つ、およびTET3の3つのアイソフォームが含まれます。^{[22] [23]}全長の標準的なTET1アイソフォームは、初期胚、胚性幹細胞、および始原生殖細胞（PGC）に事実上限定されているようです。ほとんどの体細胞組織、少なくともマウスにおける優勢なTET1アイソフォームは、代替プロモーターの使用から生じ、短い転写産物とTET1sと呼ばれる短縮タンパク質が生じます。TET3のアイソフォームは、全長フォームTET3FL、短いスプライスバリアントTET3s、および卵母細胞とニューロンで発生するTET3oと呼ばれるフォームです。TET3oは代替プロモーターの使用によって生成され、11個のアミノ酸をコードする追加の第1のN末端エクソンが含まれています。 TET3o は卵母細胞とニューロンにのみ存在し、胚性幹細胞や他の細胞タイプ、あるいは試験された成体マウス組織では発現しません。TET1 の発現は卵母細胞と接合子ではほとんど検出されず、TET2 は中程度にしか発現しませんが、TET3 変異体 TET3o は卵母細胞と接合子で非常に高いレベルの発現を示しますが、2 細胞期ではほとんど存在しません。1 細胞期のニューロン、卵母細胞、接合子で高いレベルの TET3o は、これらの細胞で非常に大規模な急速な脱メチル化が発生するときに利用される主要な TET 酵素である可能性があります。

TET酵素は、リクルートされた場合を除いて、5-メチルシトシンに特異的に結合しません。リクルートやターゲティングがない場合、TET1は、非メチル化CGIを認識できるCXXCドメインによって、ゲノム全体の高CGプロモーターとCpGアイランド（CGI）に主に結合します。^[24] TET2はDNA中の5-メチルシトシンに対する親和性がありません。^[25]ニューロンで発現する主な形態である全長TET3のCXXCドメインは、Cが5-カルボキシシトシン（5caC）に変換されたCpGに最も強く結合します。ただし、メチル化されていないCpGにも結合します。^[23]

TET酵素が脱メチル化を開始するには、まずDNAのメチル化されたCpG部位にリクルートされる必要があります。TET酵素をDNAのメチル化されたシトシンにリクルートすることが示されているタンパク質のうちの2つは、OGG1（図「CpG部位でのDNA脱メチル化の開始」を参照）^[26]とEGR1です。^[27]

オキソグアニングリコシラーゼ（OGG1）は、酸化損傷を受けた塩基8-OHdGの塩基除去修復の第一段階を触媒する。OGG1は、線状DNAに沿って0.1秒で1,000塩基対のDNAをスライドして8-OHdGを見つける。^[28] OGG1は非常に迅速に8-OHdGを見つける。OGG1タンパク質は、約6秒の半減期で酸化損傷を受けたDNAに結合します。^[29] OGG1は8-OHdGを見つけると、構造を変え、その結合ポケットで8-OHdGと複合体を形成する。^{[30] OGG1はすぐには8-OHdGを除去するように作用しない。8-OHdGの半減期の除去には、} in vitroのHeLa細胞で約30分、^[31]または放射線照射されたマウスの肝臓で約11分かかる。^[32]活性酸素種によるDNA酸化は、5-メチルシトシンに隣接するグアニン塩基のイオン化ポテンシャルが低いため、メチル化されたCpG部位のグアニンで優先的に起こります。^[33] TET1は、8-OHdGに結合したOGG1に結合（リクルート）します（図を参照）。^{[26]これにより、TET1は隣接するメチル化シトシンを脱メチル化できると考えられます。ヒト乳腺上皮細胞（MCF-10A）をH} ₂ O ₂で処理すると、DNA中の8-OHdGが3.5倍に増加し、MCF-10Aゲノムの5-メチルシトシンの約80％が脱メチル化されました。^[26]

早期成長反応タンパク質1（EGR1）遺伝子は、前初期遺伝子（IEG）です。EGR1は、神経活動によって急速に誘導されます。^[34] IEGの特徴は、タンパク質合成とは無関係に、mRNAレベルが数分以内に迅速かつ一時的に上昇することです。^[35]成人では、EGR1は脳全体に広く発現し、内側前頭前皮質、線条体、海馬、扁桃体など、脳のいくつかの重要な領域でベースライン発現レベルを維持しています。^[35]この発現は、認知、感情反応、社会的行動、報酬に対する感受性の制御に関連しています。^[35] EGR1は、モチーフ5′-GCGTGGGCG-3′および5′-GCGGGGGCGG-3′を持つ部位でDNAに結合し、これらのモチーフは主に遺伝子のプロモーター領域に存在します。^[34]短いアイソフォームTET1sは脳で発現しています。 EGR1とTET1sは、DNAとの関連とは無関係に、両タンパク質のC末端領域を介して複合体を形成する。^[34] EGR1はTET1sをEGR1結合部位に隣接するゲノム領域にリクルートする。^[34] EGR1の存在下では、TET1sは遺伝子座特異的な脱メチル化と、EGR1によって制御される下流遺伝子の発現の活性化が可能である。^[34]

上の図「5-メチルシトシンの脱メチル化」に示されているように、活性脱メチル化の最初のステップは、5-メチルシトシン（5mC）から5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）へのTET酸化です。一部の組織および一部のゲノム位置では、脱メチル化プロセスはその時点で停止する場合があります。Uribe-Lewisら^[36]がレビューしたように、活性DNA脱メチル化の中間体であることに加えて、5hmCは安定したDNA修飾であることがよくあります。ゲノム内では、5hmCは転写活性遺伝子、調節要素、およびクロマチン関連複合体に位置しています。特に、5hmCは細胞系統の指定中に動的に変化し、活性遺伝子転写と正の相関関係があり、胚性幹細胞および中枢神経系で高レベルの5hmCが見つかります。^[37]ヒトでは、5-ヒドロキシメチル化活性の欠陥は、リンパ増殖、免疫不全、自己免疫の表現型と関連している。^[38]

DNA 脱メチル化の第 3 段階は、TET 酵素によって生成された脱メチル化の中間生成物を塩基除去修復によって除去することです。上記の第 2 段階で示したように、5mC が最初に TET によって酸化されて 5hmC が形成された後、5hmC が TET によってさらに酸化されると 5fC が生成され、5fC が TET によって酸化されると 5caC が生成されます。5fC と 5caC は両方とも、塩基除去修復酵素であるDNA グリコシラーゼTDGによって異常な塩基として認識されます。このセクションの図に示すように、TDG は糖リン酸骨格をそのままにして異常な塩基 (例: 5fC) を除去し、一般にAP 部位と呼ばれるアプリン/アピリミジン部位を作成します。この図では、8-OHdG は DNA に残っています。これは、OGG1 がメチル化シトシンを使用して CpG 部位に TET1 を引き付けたときに存在していた可能性があるためです。 AP部位が形成された後、APエンドヌクレアーゼは、 TDG DNAグリコシラーゼが5fCまたは5caCを除去したときに形成されたAP部位のホスホジエステル骨格に切れ目を作ります。ヒトAPエンドヌクレアーゼは、加水分解メカニズムによってAP部位のDNA 5'を切り込み、3'-ヒドロキシルと5'-デオキシリボースリン酸（5' dRP）残基を残します。 ^[39]この後、ショートパッチ修復またはロングパッチ修復が行われます。ショートパッチ修復では、5' dRPリアーゼが5' dRP末端をトリミングして、リン酸化5'末端を形成します。その後、DNAポリメラーゼβ（pol β）が単一のシトシンを追加して、相補鎖の既存のグアニンと対になり、DNAリガーゼが切断された鎖を密封します。ロングパッチ修復では、DNA 合成はポリメラーゼ δとポリメラーゼ εによって仲介され、置換合成を行ってフラップを形成すると考えられています。Pol β もロングパッチ置換合成を行うことができます。ロングパッチ合成では、通常、2～10 個の新しいヌクレオチドが挿入されます。次に、フラップエンドヌクレアーゼがフラップを除去し、続いてDNA リガーゼが鎖を密閉します。この時点で、DNA 配列の 5-メチルシトシンがシトシンに完全に置換されています (脱メチル化)。

運動は学習と記憶に有益な効果があることがよく知られています（運動の神経生物学的効果を参照）。BDNFは特に学習と記憶の重要な調節因子です。^[40] Fernandesら^[41]がラットでレビューしたように、運動は記憶形成に重要な役割を果たす遺伝子Bdnfの海馬での発現を促進します。Bdnfの発現促進はエクソンIVのCpGアイランドプロモーターの脱メチル化によって起こり^[41]、この脱メチル化は2つの図に示されているステップに依存します。^[20]

健康な成人を対象とした調査では、総DNAメチル化と交通関連大気汚染への曝露との間に負の相関関係が認められた。DNAメチル化レベルは、黒色炭素とベンゼンへの最近および慢性の曝露と関連していた。^[42]

成人の末梢神経系のニューロンは、損傷後、軸索の成長がほとんどない休眠状態から、力強い軸索再生へと切り替わることができる。成熟した哺乳類のニューロンにおけるDNAの脱メチル化は、軸索再生の障壁を取り除く。^[43]再生中のマウスの末梢神経細胞におけるこの脱メチル化は、TET3に依存してDNA中に5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）を生成する。 ^{[43] [44] 5hmCは、ニューロンの軸索成長能を制御する}Atf3、Bdnf、Smad1などのよく知られたRAGを含む、多数の再生関連遺伝子（RAG）で変化していた。^[44]