蛍光相関分光法

蛍光相関分光法（FCS ）は、時間相関を介して蛍光強度の定常変動を統計的に分析するものです。その理論的根拠は、L.オンサガーの回帰仮説に由来しています。この分析は、変動の根底にある物理プロセスの運動パラメータを提供します。この興味深い応用例の1つは、溶液中の蛍光粒子（分子）の濃度変動の分析です。この応用例では、少数の蛍光粒子（分子）を含む溶液中の非常に小さな空間から放出される蛍光を観察します。蛍光強度は、粒子のブラウン運動により変動します。言い換えれば、光学系によって定義されたサブスペース内の粒子の数は、平均数の周りでランダムに変化しています。この分析により、蛍光粒子の平均数と、粒子が空間を通過するときの平均拡散時間がわかります。最終的に、粒子（分子）の濃度とサイズの両方が決定されます。両方のパラメータは、生化学研究、生物物理学、化学において重要です。

FCS は、少量の分子 (ナノモル濃度からピコモル濃度) を小さな体積 (~1 μm ³ ) で観察するため、非常に高感度な分析ツールです。^{[1]他の方法 (} HPLC分析など) とは異なり、FCS には物理的な分離プロセスがありません。代わりに、光学によって空間分解能を実現します。さらに、FCS を使用すると、生細胞内の生化学経路で蛍光タグ付き分子を観察できます。^[2]これにより、「in situ または in vivo 生化学」という新しい領域が開かれ、無傷の細胞や臓器内の生化学経路を追跡できます。^[3]

一般的に、FCS は光学顕微鏡、特に共焦点顕微鏡または2 光子励起顕微鏡の分野で採用されています。これらの技術では、光がサンプルに焦点を合わせられ、測定された蛍光強度の変動 (拡散、物理的または化学反応、凝集などによる) が時間的自己相関を使用して分析されます。測定された特性は本質的に変動の大きさや量に関連しているため、個々の種が観察ボリュームに出入りする (またはボリューム内でオン/オフになる) レベルで最適な測定体制が存在します。同時に測定されるエンティティが多すぎると、全体の変動が全信号に比べて小さくなり、分解できない可能性があります。逆に、個々の変動イベントが時間的にまばらすぎると、1 回の測定に非常に長い時間がかかる可能性があります。FCS は、ある意味では、(非コヒーレントな) 蛍光ではなくコヒーレントな光散乱を使用する 動的光散乱の蛍光版です。

適切なモデルが分かっている場合、FCSは次のような定量的な情報を得るために使用できます。

• 拡散係数
• 流体力学的半径
• 平均濃度
• 化学反応速度
• 一重項-三重項ダイナミクス

蛍光マーカーはさまざまな色があり、特定の分子（タンパク質、ポリマー、金属錯体など）に特異的に結合することができるため、（複合溶液中で次々と現れる）個々の分子の挙動を研究することができます。アバランシェフォトダイオードなどの高感度検出器の開発により、非常に希薄なサンプル中の個々の分子から発せられる蛍光信号の検出が実用的になりました。これにより、材料科学から生物学まで、さまざまな標本で FCS 実験を行う可能性が生まれました。遺伝子タグ付きタンパク質（緑色蛍光タンパク質など）を持つ人工細胞の出現により、FCS は生細胞における分子動態の研究によく使われるツールになりました。^[4]

信号相関技術は、1972年にマグデ、エルソン、ウェッブによって初めて実験的に蛍光に適用され、^[5]そのため、FCSの発明者として一般的に認められています。この技術は、その後すぐにこれらの著者と他の著者による一連の論文でさらに発展し、理論的基礎とアプリケーションの種類を確立しました。^{[6] [7] [8]} 1990年頃、十分に少数の蛍光粒子を検出できるようになったことで、2つの問題が浮上しました。蛍光強度の非ガウス分布とレーザー顕微鏡システムの3次元共焦点測定ボリュームです。^[9] 前者は、分子情報を抽出するための蛍光信号の分布とモーメントの分析につながり、^{[10] [11]}最終的に輝度分析として知られる一連の方法になりました。その時期のレビューについては、 Thompson (1991) ^{[12]を参照してください。}

1993 年以降、^[13]測定技術が数多く改良され、特に共焦点顕微鏡法、次いで 2 光子顕微鏡法の使用により測定体積をより適切に定義し、バックグラウンドを排除できるようになり、信号対雑音比が大幅に改善され、単一分子の感度が可能になりました。^{[14] [15]}それ以来、FCS への関心が再び高まり、2007 年 8 月の時点で、Web of Science には FCS を使用した 3,000 件を超える論文が掲載されています。レビューについては、Krichevsky と Bonnet ^[16]を参照してください。さらに、FCS をさまざまな方法で拡張する活動が活発に行われており、たとえば、レーザー走査型共焦点顕微鏡法や回転ディスク型共焦点顕微鏡法 (静止した単一点測定から)、2 つの蛍光チャネル間の相互相関 (FCCS) を自己相関の代わりに使用したり、蛍光の代わりにフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET) を使用したりしています。

一般的な FCS セットアップは、レーザー ライン (波長範囲は通常 405～633 nm (連続光)、および 690～1100 nm (パルス)) で構成され、これはダイクロイック ミラーによって顕微鏡の対物レンズに反射されます。レーザー ビームはサンプルに焦点を合わせられます。サンプルには蛍光粒子 (分子) が非常に希釈されているため、焦点内にはほんのわずかしかありません (通常、1 fL あたり 1～100 個の分子)。粒子が焦点体積を通過すると、蛍光を発します。この光は同じ対物レンズによって収集され、励起光に対して赤方偏移しているため、ダイクロイック ミラーを通過して検出器 (通常は光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード検出器、または超伝導ナノワイヤ単一光子検出器)に到達します。結果として得られる電子信号は、強度対時間トレースとして直接保存して後で分析することも、計算して自己相関を直接生成することもできます (これには特別な取得カードが必要です)。 FCS曲線自体は時間スペクトルのみを表す。物理現象に関する結論は適切なモデルを用いてそこから導き出されなければならない。関心のあるパラメータは自己相関曲線をモデル化された関数形に当てはめることで求められる。^[17]

測定ボリュームは、関係する光学素子から生じる照明 (励起) と検出ジオメトリの畳み込みです。結果のボリュームは、点像分布関数(PSF) によって数学的に記述され、基本的には点光源のイメージです。PSF は、焦点直径が数百ナノメートル、光軸に沿ってほぼ 1 マイクロメートルの楕円体 (境界がはっきりしない) として記述されることがよくあります。形状は光学素子の品質によって大きく異なり (結果として得られる FCS 曲線に大きな影響を与えます)、非点収差を避け、機器上で PSF の実際の形状を確認することが重要です。共焦点顕微鏡の場合、および小さなピンホール (約 1 エアリー単位) の場合、PSF はガウス分布によって適切に近似されます。

${\displaystyle PSF(r,z)=I_{0}e^{-2r^{2}/\omega _{xy}^{2}}e^{-2z^{2}/\omega _{z}^{2}}}$

ここで、はピーク強度、 r と z は半径と軸方向の位置、 とは半径と軸方向の半径、 です。このガウス形式は、自己相関の関数形式を導出する際に仮定されます。 ${\displaystyle I_{0}}$${\displaystyle \omega _{xy}}$${\displaystyle \omega _{z}}$${\displaystyle \omega _{z}>\omega _{xy}}$

通常は200～300 nmで、2～6倍の大きさです。^[18]測定体積パラメータを較正する一般的な方法の1つは、拡散係数と濃度が既知の種に対してFCSを実行することです（以下を参照）。一般的な蛍光体の水中での拡散係数については、後のセクションで説明します。 ${\displaystyle \omega _{xy}}$${\displaystyle \omega _{z}}$

ガウス近似は光学的詳細に応じてさまざまな程度に機能し、近似の誤差を相殺するために補正が適用されることもあります。^[19]

(時間的)自己相関関数は、時間 だけシフトした時系列の相関をの関数として表したものです。 ${\displaystyle \tau }$${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle G(\tau )={\frac {\langle \delta I(t)\delta I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}={\frac {\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}-1}$

ここで、は平均強度からの偏差です。ここでの正規化（分母）は、FCS で最も一般的に使用されます。なぜなら、G (0) での相関が、測定体積内の粒子の平均数に関係するからです。 ${\displaystyle \delta I(t)=I(t)-\langle I(t)\rangle }$${\displaystyle \tau =0}$

例として、自由に拡散するローダミン 6G の生の FCS データとその自己相関を右の図に示します。上のグラフは、蛍光強度と時間の関係を示しています。ローダミン 6G が焦点体積に出入りするにつれて、強度は変動します。下のグラフは、同じデータの自己相関です。拡散速度と濃度に関する情報は、以下に説明するモデルのいずれかを使用して取得できます。

ガウス分布の照明プロファイルの場合、自己相関関数は一般的なマスター式^{[20]で与えられる。}${\displaystyle PSF(r,z)}$

${\displaystyle G(\tau )={\frac {1}{\langle N\rangle }}\left\langle \exp \left(-{\frac {\Delta X(\tau )^{2}+\Delta Y(\tau )^{2}}{w_{xy}^{2}}}-{\frac {\Delta Z(\tau )^{2}}{w_{z}^{2}}}\right)\right\rangle ,}$

ここで、ベクトルは、時間 後の蛍光体の空間における確率的変位を表します。この式は、焦点体積内の蛍光体の平均数が少なく、蛍光体の暗状態などが無視できる場合に有効です。特に、調査中の拡散運動の種類については仮定していません。この式により、 は(i) 小さなビームパラメータの戻り確率、および (ii)が変化する場合はのモーメント生成関数として解釈できます。 ${\displaystyle \Delta {\vec {R}}(\tau )=(\Delta X(\tau ),\Delta Y(\tau ),\Delta Z(\tau ))}$${\displaystyle \tau }$${\displaystyle \langle N\rangle }$${\displaystyle G(\tau )}$${\displaystyle w_{xy},w_{z}}$${\displaystyle |\Delta {\vec {R}}(\tau )|^{2}}$${\displaystyle w_{xy},w_{z}}$

関心のある量を抽出するために、通常は非線形最小二乗アルゴリズムを使用して自己相関データをフィッティングすることができます。フィッティングの関数形式は、ダイナミクスのタイプ（および問題の光学形状）によって異なります。

FCS で使用される蛍光粒子は小さいため、溶液中で熱運動をします。したがって、最も単純な FCS 実験は通常の 3D 拡散であり、その自己相関は次のようになります。

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1/2}}}+G(\infty )}$

ここで、は測定体積の軸方向半径と半径の比であり、は特性滞留時間です。この形式は、測定体積がガウス分布であると仮定して導出されました。通常、フィッティングには 3 つの自由パラメータ G(0)、、があり、そこから拡散係数と蛍光体濃度が得られます。 ${\displaystyle a=\omega _{z}/\omega _{xy}}$${\displaystyle e^{-2}}$${\displaystyle \tau _{D}}$${\displaystyle G(\infty )}$${\displaystyle \tau _{D}}$

前のセクションで使用した正規化により、G (0) は体積 <N> 内の拡散器の平均数、または観測体積のサイズがわかっている場合は平均濃度を与えます。

${\displaystyle \ G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}={\frac {1}{V_{\text{eff}}\langle C\rangle }},}$

ここで、有効体積は測定体積のガウス形式を積分することで求められ、次のように表されます。

${\displaystyle \ V_{\text{eff}}=\pi ^{3/2}\omega _{xy}^{2}\omega _{z}.\,}$

Dは拡散係数を与えます:

${\displaystyle \ D=\omega _{xy}^{2}/{4\tau _{D}}.}$

拡散粒子が障害物によって妨げられたり、力（分子モーター、流れなど）によって押されたりする場合、そのダイナミクスは、平均二乗変位（MSD）が時間とともに線形に増加する通常の拡散モデルでは十分に説明できないことがよくあります。代わりに、拡散は異常拡散としてより適切に説明される可能性があり、この場合、MSD の時間依存性はべき乗法則のように非線形になります。

${\displaystyle \ MSD=6D_{a}t^{\alpha }\,}$

ここで、は異常拡散係数です。「異常拡散」は、通常、この非常に一般的なモデルのみを指し、異常として説明される可能性のある他の多くの可能性を指すものではありません。また、べき乗法則は、厳密には、障害物の分布がフラクタルである場合など、厳密に定義された狭い範囲のシステムに対してのみ予想される形式です。それでも、べき乗法則は、より広い範囲のシステムに対して有用な近似値になり得ます。 ${\displaystyle D_{a}}$

異常拡散の FCS 自己相関関数は次のとおりです。

${\displaystyle G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D})^{\alpha })(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D})^{\alpha })^{1/2}}}+G(\infty ),}$

ここで、異常指数は上記と同じであり、フィッティングにおける自由パラメータになります。 ${\displaystyle \alpha }$

FCSを用いると、異常指数は分子の混雑度の指標となることが示されています（1未満で、混雑度が高いほど小さくなります）。^[21]

異なるサイズ（拡散係数）を持つ拡散粒子がある場合、単一成分形式の合計である関数に適合させるのが一般的です。

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0)\sum _{i}{\frac {\alpha _{i}}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty )}$

ここで、合計はiでインデックス付けされた粒子の異なるサイズの数であり、各タイプの量子収率と濃度に関連する重み付けを与えます。これにより新しいパラメータが導入され、高次元空間を検索する必要があるため、フィッティングがより困難になります。非線形最小二乗フィッティングは、通常、sの数が少ない場合でも不安定になります。特に多分散サンプルに便利な、より堅牢なフィッティングスキームは、最大エントロピー法です。^[22]${\displaystyle \alpha _{i}}$${\displaystyle \tau _{D,i}}$

拡散と横方向の速度を持つ均一な流れを合わせると、自己相関は次のようになる。 ^[23]${\displaystyle v}$

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1/2}}}\times \exp[-(\tau /\tau _{v})^{2}\times {\frac {1}{1+\tau /\tau _{D}}}]+G(\infty )}$

流れのみ（拡散なし）の場合の平均滞留時間は どこですか。${\displaystyle \tau _{v}=\omega _{xy}/v}$

考えられる幅広い FCS 実験には、熱運動により平衡から絶えず変動する (そして「緩和」する) 化学反応が含まれます。緩和プロセスでもある拡散とは対照的に、変動は異なるエネルギーの状態間の変化を引き起こします。化学緩和を示す非常に単純なシステムの 1 つは、測定ボリューム内の固定結合サイトです。この場合、粒子は結合したときにのみ信号を生成します (たとえば、FRET によって、または拡散時間がサンプリング間隔よりもはるかに速い場合)。この場合、自己相関は次のようになります。

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0)\exp(-\tau /\tau _{B})+G(\infty )}$

どこ

${\displaystyle \ \tau _{B}=(k_{\text{on}}+k_{\text{off}})^{-1}}$

は緩和時間であり、反応速度論（オンとオフの速度）に依存します。

${\displaystyle G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}{\frac {k_{on}}{k_{off}}}={\frac {1}{\langle N\rangle }}K}$

平衡定数Kと関係があります。

化学緩和を伴うほとんどのシステムは、測定可能な拡散も示し、自己相関関数はシステムの詳細によって異なります。拡散と化学反応が切り離されている場合、複合自己相関は、化学的自己相関と拡散的自己相関の積になります。

上記の自己相関は、変動が粒子の蛍光特性の変化によるものではないことを前提としています。しかし、ほとんどの（生体）有機蛍光体（緑色蛍光タンパク質、ローダミン、Cy3、Alexa Fluor染料など）では、照射された粒子の一部が三重項状態（またはその他の非放射性崩壊状態）に励起され、その後、特徴的な緩和時間 の間光子を放出しません。通常、 はマイクロ秒のオーダーで、これは通常、対象のダイナミクス（例）よりも小さいですが、測定するには十分な大きさです。三重項状態を考慮するために、自己相関に乗法項が追加されます。通常の拡散の場合： ${\displaystyle \tau _{F}}$${\displaystyle \tau _{F}}$${\displaystyle \tau _{D}}$

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {(1-F+Fe^{-\tau /\tau _{F}})}{(1-F)}}{\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty )}$^[24]

ここで、 は三重項状態に入った粒子の割合であり、は対応する三重項状態の緩和時間です。 関心のあるダイナミクスが三重項状態の緩和よりもはるかに遅い場合、自己相関の短時間成分は単純に切り捨てられ、三重項項は不要になります。 ${\displaystyle \ F}$${\displaystyle \ \tau _{F}}$

FCS で使用される蛍光種は、通常、蛍光体でタグ付けされた (たとえば免疫組織化学を使用して) 対象の生体分子、または対象の環境 (たとえば、細胞の細胞骨格) を調べるために使用される裸の蛍光体です。次の表は、室温での水中における一般的な蛍光体の拡散係数と、その励起波長を示しています。

FCS はほとんどの場合、単一ポイント、単一チャネル、時間的自己相関測定を指しますが、歴史的な科学的文脈から外れた「蛍光相関分光法」という用語は、そのような制限を意味しません。FCS は、さまざまな研究者によってさまざまなバリエーションに拡張されており、各拡張ごとに別の名前 (通常は頭字語) が生成されています。

FCS は、特定の観測体積での拡散時間を提供する点測定ですが、svFCS は、観測スポットを変えて、異なるスポット サイズでの拡散時間を測定する手法です。拡散時間とスポット面積の関係は直線であり、プロットして閉じ込めの主な寄与を解明することができます。結果として得られる曲線は拡散法則と呼ばれます。この手法は、生物学において、生きた細胞の細胞膜組織を研究するために使用されます。

${\displaystyle \ \omega _{xy}^{2}=4D\tau _{D}+t_{0}}$

ここで、は y 軸切片です。ブラウン拡散の場合は です。孤立したドメインによる閉じ込めの場合は ですが、孤立したドメインの場合は です。 ${\displaystyle t_{0}}$${\displaystyle t_{0}=0}$${\displaystyle t_{0}>0}$${\displaystyle t_{0}<0}$

生きた細胞とシミュレーションに関するsvFCS研究論文^{[32] [33] [34] [35] [36]}

サンプリングボリューム制御蛍光相関分光法（SVC-FCS）: ^[37]

ZスキャンFCS ^[38]

ナノアパーチャを用いたFCS：回折障壁の突破^[39]

STED-FCS: ^[40]

FCS は、拡散時間の違いを利用して分子相互作用を研究するために使用されることがあります (例: 会合反応の生成物は大きくなり、したがって個々の反応物よりも拡散時間が長くなります)。ただし、FCS は分子量に対して比較的鈍感であり、これは分子量と球状粒子 (例: タンパク質) の拡散時間を関連付ける次の式からわかります。

${\displaystyle \ \tau _{D}={\frac {3\pi \omega _{xy}^{2}\eta }{2kT}}(M)^{1/3}}$

ここで、はサンプルの粘度、は蛍光種の分子量です。実際には、拡散時間は十分に異なる必要があります（少なくとも1.6倍）。つまり、分子量は4倍異なる必要があります。^[41]二色蛍光相互相関分光法（FCCS）は、2つ以上の蛍光チャネル（各反応物に1つのチャネル）を相互相関させることで相互作用を測定します。これにより、特に反応中の質量変化が小さい場合に、FCSよりも感度よく相互作用を区別できます。 ${\displaystyle \ \eta }$${\displaystyle \ M}$

この一連の方法には、数と輝度（N&B）^[42] 、光子計数ヒストグラム（PCH）^[43] 、蛍光強度分布解析（FIDA）^[44] 、およびキュムラント解析^[45]が含まれます。空間強度分布解析^[46] 。複数の方法の組み合わせも報告されています。^[47] 蛍光相互相関分光法は、多色の一致を見ることで、拡散速度の分子量への弱い依存性を克服します。ホモ相互作用はどうでしょうか？解決策は輝度解析にあります。これらの方法は、蛍光の強度分布の不均一性を利用して、サンプル内の異なる種の分子輝度を測定します。二量体には単量体の2倍の蛍光ラベルが含まれるため、その分子輝度は単量体の約2倍になります。その結果、相対輝度はオリゴマー化の感度の高い指標になります。平均分子輝度（）は、分散（）および平均強度（）と次のように関係しています。^[48]${\displaystyle \langle \epsilon \rangle }$${\displaystyle \sigma ^{2}}$${\displaystyle \langle I\rangle }$

${\displaystyle \ \langle \varepsilon \rangle ={\frac {\sigma ^{2}-\langle I\rangle }{\langle I\rangle }}=\sum _{i}f_{i}\varepsilon _{i}}$

ここで、およびはそれぞれ、種 の部分強度と分子輝度です。輝度分析法は、非蛍光反応物が蛍光反応物に結合した際の生体分子の相互作用を研究するために使用できます。^[49]複合体の形成により、立体遮蔽、電荷移動、光異性化速度、またはこれらの現象の組み合わせにより輝度強度が変化し、反応物と生成物を区別できるようになります。 ${\displaystyle f_{i}}$${\displaystyle \epsilon _{i}}$${\displaystyle i}$

分子相互作用を研究するための別のFCSベースのアプローチは、蛍光の代わりに蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を使用し、FRET-FCSと呼ばれます。 ^[50] FRETでは、FCCSと同様に2種類のプローブがありますが、チャネルは1つしかなく、2つのプローブが非常に近い（相互作用を確実にするのに十分なほど近い）場合にのみ光が検出されます。FRET信号は蛍光よりも弱いですが、反応中にのみ信号があるという利点があります（自己蛍光を除く）。

走査型蛍光相関分光法（sFCS）では、測定体積がサンプル上で定義された方法で移動します。走査の導入は、標準的なFCSでよく発生するいくつかの異なる問題を軽減または排除する能力によって動機付けられ、それによって生物システムにおける蛍光相関法の適用範囲が拡大されます。^[51]

FCS のいくつかのバリエーションは、シリアル走査型レーザー顕微鏡にのみ適用できます。画像相関分光法とそのバリエーションはすべて走査型共焦点顕微鏡または走査型 2 光子顕微鏡で実装されていますが、回転ディスク共焦点顕微鏡などの他の顕微鏡にも適用できます。ラスター ICS (RICS) ^[52]と位置感度 FCS (PSFCS) ^{[53] は、}画像スキャンの部分間の時間遅延を分析に組み込みます。また、低次元スキャン (円形リングなど) ^[54] (走査システムでのみ可能) は、単一点測定と画像全体の測定間の時間スケールにアクセスできます。走査パスも粒子を適応的に追跡するように作られています。^[55]

画像相関分光法はいずれも回転ディスク共焦点顕微鏡でも実行でき、実際にはレーザー走査共焦点顕微鏡に比べてより高速な画像化速度が得られます。このアプローチは最近、空間的に変化する複雑な環境における拡散に適用され、拡散係数のピクセル解像度マップが作成されました。^[56] FCSによる拡散の空間マッピングはその後、TIRFシステムに拡張されました。^{[57]相関技術を使用したダイナミクスの空間マッピングは以前にも適用されていましたが、まばらなポイント[58]}または粗い解像度でのみ適用されていました。^[59]

動きが遅い場合（生物学では膜内の拡散など）、単一点FCS実験から適切な統計値を得るには、非常に長い時間がかかることがあります。レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、複数の空間点で実験を並行して実行することで、より多くのデータを取得できます。このアプローチは、画像相関分光法（ICS）と呼ばれています。^[60]その後、測定値を平均化できます。

ICSの別のバリエーションは、画像に対して空間的自己相関を実行し、粒子の濃度に関する情報を提供します。^[61]その後、相関は時間的に平均化されます。カメラのホワイトノイズは時間的には自己相関しませんが、空間的には自己相関します。これにより、空間的自己相関関数にホワイトノイズ振幅が生成され、蛍光分子の濃度を見つけるために自己相関振幅をフィッティングするときに考慮する必要があります。

時間相関と空間相関バージョンの自然な拡張は、時空間ICS（STICS）です。^[59] STICSでは、空間または時間における明示的な平均化はありません（相関に固有の平均化のみ）。非等方性運動（例えば、方向性のある流れ、非対称拡散）のシステムでは、STICSは方向情報を抽出できます。STICS（フーリエ変換による）と密接に関連するバリエーションは、k空間画像相関分光法（kICS）です。^[62]

ICSには相互相関バージョンもあり、共局在する蛍光分子の濃度、分布、ダイナミクスを算出できる。^[60]蛍光強度の点広がり関数が重なり合って個々の蛍光寄与が区別できない場合、分子は共局在していると考えられる。

出典: ^[63]

PICS は、ナノメートルの長さとミリ秒の時間スケールで相関関係を解明する強力な分析ツールです。時空間画像相関分光法^[59]を応用したもので、単一粒子追跡の高い位置精度を活用しています。従来の追跡方法は、複数の粒子の軌跡が交差すると機能しなくなりますが、この方法は、個々の分子を識別できる限り、任意の大きな分子密度と動的パラメータ (拡散係数、速度など) に対して原理的に機能します。計算コストが安く、堅牢で、ダイナミクスに関する事前の知識がなくても、粒子の集団内の動き (拡散、能動輸送、閉じ込め拡散など) を識別して定量化できます。

粒子画像相互相関分光法（PICCS）の拡張は、2色顕微鏡で観察できるように、複数の相互作用パートナーが関与する生物学的プロセスに利用できます。^[64]

超解像光揺らぎイメージング（SOFI）は、FCSと同様に相関方程式を用いた後処理解析によって回折限界以下の空間分解能を達成する超解像技術である。SOFIの元の報告では蛍光体の静止した点滅による揺らぎが使用されていたが、FCSはSOFIと組み合わされ、拡散プローブから揺らぎが生成され、拡散係数の超解像空間マップが作成される。^[65]これは、多孔質で閉じ込められた材料の拡散および空間特性を理解するために適用されている。これには、アガロース^[65]、温度応答性PNIPAMハイドロゲル^[66] 、液晶^[65] 、相分離ポリマー、RNA/タンパク質凝縮物^{[67]などが含まれる。}

全反射蛍光（TIRF）は、カバーガラスの表面近くの薄い層にのみ反応する顕微鏡法であり、バックグラウンドの蛍光を大幅に最小限に抑えます。FCSはこのタイプの顕微鏡に拡張され、TIR-FCSと呼ばれています。^[68] TIRFの蛍光強度はカバーガラスからの距離とともに指数関数的に減少するため（共焦点のガウス分布としてではなく）、自己相関関数が異なります。

光シート蛍光顕微鏡法または選択的平面画像顕微鏡法（SPIM）は、薄いシート（レーザー）光を使用して、観察方向に対して垂直に照明を行う。特定の条件下では、この照明原理を蛍光相関分光法と組み合わせることで、生きた生物学的サンプル内のGFP標識タンパク質などの蛍光粒子の移動と相互作用を空間的に分解した画像化が可能になる。^[69]

蛍光種のダイナミクスを研究するために広く使用されている FCS の非相関代替法は主に 2 つあります。

FRAPでは、ある領域が短時間、強い光にさらされ、蛍光体が回復不能なほど光退色し、近くの（退色していない）蛍光体の拡散による蛍光回復が画像化されます。FCS に対する FRAP の主な利点は、細胞生物学で一般的な定性実験の解釈が容易なことです。細胞株間、細胞領域間、または薬剤適用前後の違いは、多くの場合、動画を単純に検査するだけで特徴付けることができます。FCS 実験には、一定レベルの処理が必要であり、回転拡散、振動、光退色、照明と蛍光色への依存、不適切な統計など、潜在的に交絡する影響に対してより敏感です。FRAP では測定ボリュームを変更する方がはるかに簡単で、より優れた制御が可能です。実際には、ボリュームは通常、FCS よりも大きくなります。FRAP 実験は通常、より定性的ですが、一部の研究者は FRAP を定量的に研究し、結合ダイナミクスを含めています。^[70]細胞生物学におけるFRAPの欠点は、光退色によって引き起こされる細胞のフリーラジカルの摂動である。また、濃度や回転拡散、共局在を測定できないため、汎用性が低い。FRAPは、FCSよりもはるかに高い濃度の蛍光体を必要とする。

粒子追跡では、通常、粒子追跡アルゴリズムを動画に適用することで、一連の粒子の軌跡が測定されます。[1] 粒子追跡の利点は、相関によってダイナミクスが単一の滑らかな曲線に平均化される FCS とは異なり、測定ですべての動的情報が維持されることです。この利点は、複雑な拡散を示すシステムで明らかです。このシステムでは、平均二乗変位を直接計算することで、通常の拡散やべき乗拡散と簡単に比較できます。粒子追跡を適用するには、粒子を識別可能にする必要があり、そのため FCS で必要な濃度よりも低い濃度にする必要があります。また、粒子追跡はノイズの影響を受けやすく、結果に予期しない影響を与えることがあります。

紫外線ナノフォトニクスの最近の進歩により、ラベルフリータンパク質を深紫外線で励起し、その動的過程を研究することで、単一分子研究が可能になった。^{[71] [72] [73]}

2光子励起または3光子励起FCSでは、空間分解能と有機および/または生物学的サンプルにおける光損傷/光退色を最小限に抑えるという点でいくつかの利点が得られる。^{[74] [75] [76] [77] [78]}

• 共焦点顕微鏡
• 拡散係数
• 動的光散乱
• 蛍光相互相関分光法（FCCS）
• フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)

• Rigler R. および Widengren J. (1990)。蛍光相関分光法による単一分子の超高感度検出、BioScience (Ed. Klinge & Owman) p. 180
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• FCS教室
• ストワーズ研究所 FCS チュートリアル
• Cell Migration Consortium FCS チュートリアル 2010-09-24 にWayback Machineでアーカイブされました
• 蛍光相関分光法 (FCS) (Becker & Hickl GmbH、ウェブページ)