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サンガーシーケンス法は、 DNAポリメラーゼによるin vitro DNA複製中の鎖終結ジデオキシヌクレオチドのランダムな取り込みに基づく、電気泳動を伴うDNAシーケンス法である。1977年にフレデリック・サンガーらが初めて開発した後、約40年間、最も広く使用されたシーケンス法となった。スラブゲル電気泳動と蛍光標識を用いた自動装置は、1987年3月にアプライドバイオシステムズ社によって初めて商品化された。 [ 1 ]その後、自動スラブゲルは自動キャピラリーアレイ電気泳動に置き換えられた。[ 2 ]
近年、特に大規模な自動ゲノム解析においては、高容量のサンガーシーケンスは次世代シーケンス法に取って代わられつつあります。しかしながら、サンガー法は小規模なプロジェクトやディープシーケンス結果の検証には依然として広く用いられています。500ヌクレオチドを超えるDNA配列リードを生成でき、99.99%前後の精度で非常に低いエラー率を維持できるという点で、ショートリードシーケンス技術（Illuminaなど）よりも依然として優位性があります。 [ 3 ]サンガーシーケンスは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のシーケンス[ 4 ]や、米国疾病予防管理センター（CDC）のCaliciNet監視ネットワークを通じたノロウイルスのアウトブレイクの監視など、公衆衛生イニシアチブの取り組みにも積極的に利用されています。[ 5 ]
古典的な鎖終結法では、一本鎖DNAテンプレート、DNAプライマー、DNAポリメラーゼ、通常のデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、および修飾ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ddNTP）が必要であり、後者がDNA鎖伸長を終結させる。これらの鎖終結ヌクレオチドは、 2つのヌクレオチド間にホスホジエステル結合を形成するために必要な3'- OH基を欠いているため、修飾ddNTPが取り込まれるとDNAポリメラーゼによるDNA伸長が停止する。ddNTPは、自動シーケンシング装置での検出のために、放射性標識または蛍光標識することができる。
DNA サンプルは、4 つの標準デオキシヌクレオチド(dATP、dGTP、dCTP、dTTP) と DNA ポリメラーゼを含む 4 つの別々のシーケンス反応に増幅されます。各反応には、4 つのジデオキシヌクレオチド(ddATP、ddGTP、ddCTP、または ddTTP) のうちの 1 つだけが加えられ、他の添加ヌクレオチドは通常のヌクレオチドです。デオキシヌクレオチドの濃度は、対応するジデオキシヌクレオチドの濃度の約 100 倍高くする必要があります (例: 0.5mM dTTP : 0.005mM ddTTP)。これにより、完全な配列を転写しながら十分な断片が生成されます (ただし、ddNTP の濃度は、目的の配列の長さにも依存します)。[ 6 ]つまり、このプロセスでは、4 つの ddNTP すべてをテストするために 4 つの別々の反応が必要です。結合したプライマーからのテンプレート DNA 伸長のラウンドの後、生成された DNA 断片は熱変性され、ゲル電気泳動を使用してサイズ別に分離されます。 1977年の原著論文[ 6 ]では、ssDNAの塩基対ループの形成が、一部の場所でバンドを分離する上で深刻な困難を引き起こしていた。これは、変性ポリアクリルアミド-尿素ゲルを用いて、4つの反応をそれぞれ4つのレーン（レーンA、T、G、C）で実行して行われることが多い。その後、DNAバンドはオートラジオグラフィーまたはUV光で可視化でき、DNA配列はX線フィルムまたはゲル画像から直接読み取ることができる。
右側の画像では、ゲルにX線フィルムを露光しており、暗いバンドは長さの異なるDNA断片に対応しています。レーン内の暗いバンドは、ジデオキシヌクレオチド（ddATP、ddGTP、ddCTP、またはddTTP）の取り込み後に鎖終結が起こった結果生じたDNA断片を示しています。下から上に向かって4つのレーンにおける各バンドの相対的な位置関係を用いて、DNA配列を読み取ります。
鎖終結シーケンスの技術的なバリエーションには、放射性リンを含むヌクレオチドで標識して放射性標識する方法や、5'末端に蛍光色素で標識したプライマーを使用する方法などがあります。色素プライマーシーケンスは、光学システムでの読み取りを容易にし、分析や自動化を遅く困難にします。後にLeroy Hoodと共同研究者[ 7 ] [ 8 ]によって開発された蛍光標識ddNTPとプライマーは、自動化されたハイスループットDNAシーケンスの基礎を築きました。
鎖終結法はDNAシーケンスを大幅に簡素化しました。例えば、鎖終結法に基づくキットが市販されており、シーケンスに必要な試薬が分注済みで、すぐに使用できます。ただし、プライマーがDNAに非特異的に結合することでDNA配列の正確な読み取りが妨げられることや、DNAの二次構造が配列の忠実度に影響を与えることなど、いくつかの制約があります。
ダイターミネーターシークエンシングでは、鎖終結剤であるddNTPを標識することで、標識プライマー法のように4つの反応ではなく、1つの反応でシークエンシングを行うことができます。ダイターミネーターシークエンシングでは、4つのジデオキシヌクレオチド鎖終結剤それぞれに蛍光色素が標識され、それぞれの色素が異なる波長の光を発します。
ダイターミネーターシーケンシングは、その簡便性とスピードの高さから、現在では自動シーケンシングの主流となっている。しかし、その限界として、DNA断片への色素標識鎖ターミネーターの取り込み方の違いによる色素効果があり、キャピラリー電気泳動後の電子DNA配列トレース電気泳動図（クロマトグラムの一種）において、ピークの高さや形状が不均一になる（左図参照）。
この問題は、DNAポリメラーゼ酵素系や、取り込みのばらつきを最小限に抑える色素、そして「色素の塊」を除去する方法を用いることで解決されてきた。色素ターミネーター法は、自動化されたハイスループットDNAシーケンスアナライザーとともに、次世代シーケンシングが導入されるまで、シーケンスプロジェクトの大部分で使用されていた。
自動DNAシーケンス装置（DNAシーケンサー）は、1回のバッチで最大384個のDNAサンプルをシーケンスできます。バッチ実行は1日に最大24回行われる場合があります。DNAシーケンサーは、キャピラリー電気泳動を使用して鎖をサイズ（または長さ）で分離し、色素の蛍光を検出して記録し、蛍光ピークトレースクロマトグラムとしてデータを出力します。シーケンス反応（サーマルサイクリングと標識）、バッファー溶液でのサンプルのクリーンアップと再懸濁は、サンプルをシーケンサーにロードする前に別々に実行されます。多くの市販および非市販のソフトウェアパッケージは、低品質のDNAトレースを自動的にトリミングできます。これらのプログラムは、各ピークの品質をスコアし、低品質の塩基ピーク（通常はシーケンスの末端に位置する）を除去します。[ 9 ]このようなアルゴリズムの精度は、人間のオペレーターによる目視検査には劣りますが、大規模なシーケンスデータセットの自動処理には十分です。
公衆衛生分野は、患者の診断だけでなく、潜在的な有毒物質や循環する生物学的病原体の環境監視を支援する多くの役割を担っています。世界中の公衆衛生研究所（PHL）やその他の研究所は、2020年1月30日に公衆衛生上の緊急事態が宣言されたパンデミックの間、COVID-19の原因ウイルスであるSARS-CoV-2の監視のための迅速なシーケンスデータを提供する上で極めて重要な役割を果たしました。 [ 10 ]研究所は、シーケンス法の迅速な実装を任され、ウイルスの拡散を緩和するための政策の開発に関する意思決定モデルを支援するために正確なデータを提供するよう求められました。多くの研究所は次世代シーケンス法を採用し、その他はサンガーシーケンスによる取り組みを支援しました。 SARS-CoV-2のシーケンス解析は数多く行われており、ほとんどの研究所ではウイルスの全ゲノムシーケンス解析を実施しているが、スパイクタンパク質の生成に必要な情報をコードするS遺伝子など、ウイルスの特定の遺伝子のシーケンス解析を選択した研究所もある。SARS-CoV-2の高い変異率はS遺伝子内の遺伝的差異につながり、これらの差異はウイルスの感染性に影響を与えている。[ 11 ] S遺伝子のサンガーシーケンス解析は、遺伝子コードを取得するための迅速、正確、かつ低コストの方法を提供する。低所得国の研究所では、次世代シーケンス解析などの高価なアプリケーションを実施する能力がない場合があるため、変異株の監視のためのシーケンスデータの生成をサポートする上でサンガー法が主流となる可能性がある。
サンガーシーケンスは、米国疾病予防管理センター（CDC）の CaliciNet ネットワークにおけるノロウイルス監視方法の「ゴールドスタンダード」でもあります。CalciNet は、2009 年 3 月に設立されたアウトブレイク監視ネットワークです。このネットワークの目標は、米国で流行しているノロウイルスのシーケンスデータを収集し、ウイルスの拡散を抑制するために感染源を特定するための下流のアクションを活性化することです。CalciNet ネットワークは、多くの感染症を食中毒として特定しました。[ 5 ]このデータは公開され、食品の汚染を防ぐための将来のアクションに関する推奨事項を作成するために使用できます。ノロウイルスの検出に使用される方法は、ゲノムの特定の領域を標的とした増幅です。増幅産物は、色素終結サンガーシーケンスを使用してシーケンスされ、生成されたクロマトグラムとシーケンスは、BioNumericsで開発されたソフトウェア パッケージで分析されます。シーケンスは追跡され、株の関連性が研究され、疫学的関連性が推測されます。
サンガー法によるDNAシーケンスの一般的な課題としては、プライマー結合によるシーケンスの最初の15～40塩基の品質の低下や、700～900塩基以降のシーケンストレースの品質の劣化などが挙げられます。Phredなどの塩基コールソフトウェアは通常、品質の推定値を提供し、シーケンスの低品質領域のトリミングを支援します。[ 12 ] [ 13 ]
DNA断片をシーケンス前にクローニングする場合、結果として得られる配列にはクローニングベクターの一部が含まれる可能性があります。対照的に、PCRベースのクローニングやパイロシークエンシングに基づく次世代シークエンシング技術では、クローニングベクターの使用を避けることがよくあります。最近では、クローニングや事前の増幅なしに標的遺伝子を迅速にシーケンスできるAmpliseqやSeqSharpなどのワンステップサンガーシークエンシング（増幅とシークエンシングの組み合わせ）法が開発されています。[ 14 ] [ 15 ]
現在の方法では、1回の反応で直接配列決定できるDNA断片の長さは比較的短いもの（300～1000ヌクレオチド）に限られる。このサイズ制限を超えるDNA断片の配列決定における主な障害は、長さがわずか1ヌクレオチドしか違わない大きなDNA断片を分離するのに十分な分離能が得られないことである。
マイクロ流体サンガーシーケンスは、DNAシーケンスのためのラボオンチップアプリケーションであり、ナノリットルスケールのサンプル量を用いて、サンガーシーケンスの各ステップ（サーマルサイクリング、サンプル精製、キャピラリー電気泳動）をウェハースケールのチップ上に統合したものです。この技術は、サンガーシーケンスの各ステップを統合・自動化することで、従来のサンガー法の多くの重大な欠点（高価な試薬の大量消費、高価な機器への依存、人員を要する操作など）を解消し、長くて正確なシーケンスリードを生成します。
現代のハイスループットゲノムシーケンスでは、ゲノムを小さな一本鎖断片に分割し、続いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって断片を増幅します。サンガー法を採用し、各DNA断片は蛍光標識されたジデオキシ鎖終結ヌクレオチドの組み込みによって不可逆的に終結され、それぞれが1塩基ずつ長さが異なり、末端塩基に塩基特異的な蛍光標識を持つ断片のDNA「ラダー」が生成されます。増幅された塩基ラダーは、キャピラリーアレイ電気泳動（CAE）によって分離され、蛍光標識された一本鎖DNA断片の自動的なin situ「フィニッシュライン」検出によって断片の順序付けられた配列が得られます。これらの配列リードは、コンピュータによって重複または連続した配列（「コンティグ」と呼ばれる）に組み立てられ、完全に組み立てられると完全なゲノム配列に似てきます。[ 16 ]
サンガー法では、最大で約 800 bp のリード長が得られます (通常、非濃縮 DNA では 500～600 bp)。サンガー法のリード長が長いことは、特にゲノムの反復領域のシーケンスに関して、他のシーケンス法に比べて大きな利点となります。短いリードのシーケンス データは、特に新しいゲノム(de novo) のシーケンスや、高度に再編成されたゲノム セグメント (通常、がんゲノムや構造的変異を示す染色体の領域に見られるもの) のシーケンスにおいて問題となります。[ 17 ]
DNAシーケンス解析のその他の有用な応用例としては、一塩基多型（SNP）検出、一本鎖コンフォメーション多型（SSCP）ヘテロ二本鎖解析、および短鎖タンデムリピート（STR）解析などがある。ゲノムのこれらの特徴を研究する上で最も重要なステップは、サイズやコンフォメーションの違いに基づいてDNA断片を解読することである。[ 16 ]
シーケンシングチップは4層構造で、直径100mmのガラスウェハ3枚（デバイス素子が微細加工されている）とポリジメチルシロキサン（PDMS）膜から構成される。反応チャンバーとキャピラリー電気泳動チャネルは、熱接合された上部2枚のガラスウェハ間にエッチング加工されている。3次元チャネル相互接続部とマイクロバルブは、PDMS膜と下部マニホールドガラスウェハによって形成される。
この装置は、サンガーシーケンスの各ステップに対応する3つの機能ユニットで構成されています。サーマルサイクリング（TC）ユニットは、抵抗温度検出器、マイクロバルブ、および表面ヒーターを内蔵した250ナノリットルの反応チャンバーです。上部のオールガラス層と下部のガラス-PDMS層間の試薬の移動は、直径500μmのビアホールを通して行われます。サーマルサイクリング後、反応混合物は捕捉/精製チャンバーで精製され、その後、キャピラリー電気泳動（CE）チャンバーに注入されます。CEユニットは、65μm幅のターンでコンパクトなスイッチバックパターンに折り畳まれた30cmのキャピラリーで構成されています。
Apollo 100プラットフォーム（Microchip Biotechnologies Inc.、カリフォルニア州ダブリン）[ 18 ]は、サンガーシーケンスの最初の2つのステップ（サーマルサイクリングと精製）を完全に自動化されたシステムに統合しています。製造元は、サンプルと試薬をシステムにロードしてから3時間以内にサンプルがキャピラリー電気泳動の準備が整うと主張しています。Apollo 100プラットフォームでは、サブマイクロリットル量の試薬が必要です。
ハイスループットシーケンシングの究極の目標は、低コストで、より長いリード長を非常に効率的に取得できるシステムを開発することです。各電気泳動分離におけるリード長が長くなれば、de novo DNAシーケンシングに関連するコストと、特定の冗長性でDNAコンティグをシーケンスするために必要なテンプレートの数が大幅に削減されます。マイクロ流体技術により、より速く、より安価で、より容易なシーケンスアセンブリが可能になります。[ 16 ]
蛍光色素によって行われる。塩基A、C、G、Tに特異的な各反応には、それぞれ異なる色の蛍光色素が用いられる。反応混合物を混合し、単一のポリアクリルアミドゲルチューブ内で共電気泳動を行う。分離されたDNAの蛍光バンドはチューブの底付近で検出され、配列情報はコンピュータによって直接取得される。