蛍光イメージング

蛍光イメージングは​​、生体内で起こっている生物学的プロセスを視覚化できる非侵襲的なイメージング技術の一種です。画像は、顕微鏡、イメージングプローブ、分光法など、さまざまな方法で生成できます。

蛍光自体は、物質が電磁波を吸収した後に特定の波長の光を放出することによって生じる発光の一種です。光を吸収して再び光を放出する分子は蛍光体と呼ばれます。^{[1] [2]}

蛍光イメージングは​​、蛍光色素や蛍光タンパク質を撮影して分子のメカニズムや構造をマークします。これにより、生きた細胞内の遺伝子発現、タンパク質発現、分子相互作用のダイナミクスを実験的に観察できます。 ^[3]本質的には、生化学アプリケーションに関する正確で定量的なツールとして機能します。

よくある誤解ですが、蛍光と生物発光は、それぞれのプロセスで生成されるタンパク質がどのように光を生成するかという点で異なります。生物発光は、酵素が基質を分解して光を生成する化学プロセスです。蛍光は、電子の物理的な励起と、その後の戻りによる光の放出です。

ある分子が光を吸収すると、その分子のエネルギーは一時的に高い励起状態に上昇します。その後、基底状態に戻ると、検出および測定可能な蛍光が放出されます。吸収されたエネルギーhvの光子から生じる放出光には、特定の波長があります。実験の実行時に、測定装置が光の生成を検出するためにどの波長に設定すればよいかを知ることができるように、この波長を事前に知っておくことが重要です。この波長は、次の式で決定されます。

${\displaystyle \lambda _{\text{emission}}=\ {\frac {hc}{{Energy}_{\text{emission}}}}}$

ここで、h = プランク定数、c = 光速です。通常、強度を測定し、画像をデジタル撮影するために、大型の走査装置または CCD が使用されます。^[1]

蛍光色素は成熟時間がなく、蛍光タンパク質に比べて光安定性と輝度が高い。輝度に関しては、蛍光色素の吸光係数または光吸収能力と、吸収した光を蛍光発光に変換する量子効率または有効性に依存する。色素自体はそれほど蛍光性はないが、タンパク質に結合すると検出されやすくなる。一例として、NanoOrange は還元剤の影響を受けずにタンパク質のコーティング領域と疎水性領域に結合する。タンパク質に関しては、これらの分子自体が特定の入射光波長を吸収すると蛍光を発する。一例として、緑色蛍光タンパク質 (GFP) は青色から紫外線の範囲の光にさらされると緑色に蛍光を発する。蛍光タンパク質は、タンパク質の位置特定、タンパク質結合の観察、遺伝子発現の定量化に役立つ優れたレポーター分子である。^[1]

蛍光の波長の中には人間の目では捉えられないものもあるため、電荷結合素子 (CCD) を使って光を正確に検出し、発光を画像化する。これは通常 300～800 nm の範囲で起こる。蛍光シグナル伝達の利点の 1 つは、放出された光の強度が蛍光分子の量に対してかなり直線的に振舞うことだ。これは当然、吸収された光の強度と波長が一定であることが条件である。実際の画像自体に関しては、通常は 12 ビットまたは 16 ビットのデータ形式である。^[1]

蛍光イメージング システムの主なコンポーネントは次のとおりです。

• 励起源: UV 光のような広波長源、またはレーザーのような狭波長源を生成するデバイス。
• 光表示光学系: サンプルを光で照らすメカニズム。これは通常、サンプルを直接照射することによって行われます。
• 光収集光学系: 光自体の収集方法。通常はレンズ、ミラー、フィルターで構成されます。
• 放射光のフィルタリング: 光学フィルターは、反射光と散乱光が蛍光に含まれないようにします。放射フィルターには、ロングパス、ショートパス、バンドパスの 3 つのクラスがあります。
• 検出、増幅、可視化：光電子増倍管（PMT）または電荷結合素子（CCD）のいずれかを使用して、放出された光子を検出し、定量化する。

• PCR (アガロースゲル電気泳動) の場合: SYBR Green は DNA に結合する非常に一般的な染料で、アガロースゲル内の DNA バンドを視覚化するために使用されます。この染料は青色光を吸収し、緑色の蛍光を発して、画像化システムで捕捉します。
• ブロッティング（ウエスタン、ノーザン、サザン）：蛍光色素は抗体、RNA、DNAに結合して蛍光を発し、データを定量化します。
• DNAシーケンシング：サンガーシーケンシングは、蛍光標識ddNTPを使用して蛍光ピークを画像化する核酸検出の一般的な形式です。
• 蛍光画像誘導手術：腫瘍を蛍光標識してナビゲーションを支援する医療用画像診断法。例えば、インドシアニングリーンは癌患者のリンパ節を検出するために使用できます。^[4]
• 1ナノメートル精度の蛍光イメージング（FIONA）：全反射照明を利用してノイズを低減し、蛍光体の輝度を高める^[5]
• ^{カルシウムイメージング：Ca 2+}イオンに結合すると蛍光が変化するカルシウム指示薬と呼ばれる蛍光分子を利用する技術。これは神経系で細胞が活動しているかどうかを見る上で重要な部分です。^[6]
• ペグリシアニン（ルミサイト）は、乳がんの成人患者における蛍光イメージングに適応があり、乳房部分切除手術中に原発巣を切除した後、切除腔内の癌組織の術中検出を補助するために使用されます。^[7]
• 光活性化局在顕微鏡法。

さまざまな顕微鏡技術を使用して、画像の視覚化とコントラストを変更できます。それぞれの方法には長所と短所がありますが、すべて同じ蛍光メカニズムを利用して生物学的プロセスを観察します。

• 全反射蛍光顕微鏡法：エバネッセント波を利用して単一分子の蛍光を選択的に観察する顕微鏡技術。^[8]
• 光シート蛍光顕微鏡法：サンプルの薄いスライスを垂直の検査角度で照射する蛍光顕微鏡法。^[9]
• 蛍光寿命イメージング顕微鏡：蛍光の経時変化を記録するイメージング技術

• 非侵襲性：皮膚を穿刺することなく生体内での画像化が可能
• 高感度：プローブはDNA、RNA、タンパク質などの生物学的分子の検出に非常に敏感になるように設計されています。^[1]
• マルチラベリング: サンプル内で複数の蛍光色素を検出できるため、標準とコントロールを簡単に統合できます。
• 標識分子の安定性：イメージングに使用される蛍光標識分子は数か月間保存できますが、放射性標識分子などの他の分子は数日で崩壊します。^[9]
• 比較的安全に取り扱うことができます。ほとんどの蛍光体は手袋を着用すれば安全かつ十分に取り扱うことができますが、例えば放射性同位元素には鉛シールドやその他の放射線防護が必要になる場合があります。^[9]
• 廃棄が簡単: 多くの蛍光体は最小限の廃棄方法しか必要としませんが、放射性廃棄物は規制された廃棄と長期にわたる取り扱いを必要とします。これにより、これらの製品の利用に必要なコストも削減されます。

• 光退色：蛍光体では基底状態と励起状態の間を絶えず循環することで分子が損傷し、強度が低下するという問題がよく発生します。^[9]
• 環境感受性：温度、イオン濃度、pHなどの環境要因は蛍光色素の効率と放出に影響を与える可能性があります。
• 毒性：一部の蛍光色素は細胞や組織に対して毒性があり、生体内で毒性を示したり、突然変異を引き起こしたりすることがある。^[10]
• 限られた分解能: 蛍光顕微鏡は、マクロレベルで近い物体を区別する能力が限られています。比較すると、たとえば電子顕微鏡は、はるかに狭い範囲を分解する能力があります。
• 限られた初期光度範囲：入射光源の強度には限界があり、この点を超えると分子の光破壊を引き起こす可能性があります。^[1]

全体的に、この形式のイメージングは​​、生物学的プロセスを監視できるため、最先端の研究に非常に役立ちます。2D 蛍光画像から 3D 画像への進歩により、科学者は空間精度と解像度をより良く研究できるようになりました。さらに、4D 分析に向けた集中的な取り組みにより、科学者は細胞をリアルタイムで監視できるようになり、急速に作用するプロセスを監視できるようになりました。

より効果的な蛍光タンパク質の開発は、イメージングプローブの能力を向上させるために多くの科学者が取り組んでいる課題です。多くの場合、特定の残基の変異により、タンパク質の蛍光特性が大幅に変化します。たとえば、クラゲのGFPのF64L遺伝子を変異させることで、タンパク質は37°Cでより効率的に蛍光を発することができます。これは、実験室で培養物を成長させるときに重要な特性です。^[11]これに加えて、遺伝子工学により、より優れた波長または周波数で光を発するタンパク質を生成することができます。^[11]さらに、環境自体が重要な役割を果たす可能性があります。極性環境では蛍光寿命を安定させることができます。

十分に説明されているものの、必ずしも実際のアプリケーションに組み込まれているわけではないメカニズムは、蛍光イメージングに有望な可能性を秘めています。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、1～10 nmの範囲でシグナル分子を生成する非常に感度の高いメカニズムです。^[8]

蛍光プロセスを構成する技術の改善も、より効率的な設計のためには重要です。蛍光相関分光法（FCS）は、蛍光強度の変動を観察する分析技術です。この分析は多くの蛍光イメージング機器の構成要素であり、空間分解能の向上により感度と範囲が向上する可能性があります。^[8]

レーザー誘起蛍光に対するより感度の高いプローブと分析技術の開発により、より正確で最新の実験データが得られます。

• 生命科学における蛍光
• 蛍光顕微鏡

• Yu, Jyao; Harankhedkar, Shefali; Nabatilan, Arielle; Fahrni, Christopher (2021). 「第4章：生物システムにおける微量金属のイメージング」。Kroneck, Peter MH; Sosa Torres, Martha (編)。金属、微生物、鉱物：生命の生物地球化学的側面。生命科学における金属イオンシリーズの第21巻。ベルリン：Walter de Gruyter。pp. 81–134。doi ： 10.1515 / 9783110589771-010。ISBN 9783110589771. S2CID  240664558 (サブスクリプションが必要) .{{cite book}}: CS1 maint: 複数の名前: 著者リスト (リンク) CS1 maint: 追記 (リンク)