テロメラーゼ逆転写酵素

hTERTは培養中の様々な正常細胞を不死化することで、非幹細胞培養に幹細胞の自己複製能を付与します。^{[ 14 ] [ 22 ]}非幹細胞の不死化は複数の方法で達成できますが、その1つはhTERTを細胞に導入することです。分化細胞はしばしばhTERCとテロメラーゼアセンブリの形成を助けるテロメラーゼ関連タンパク質TP1を発現しますが、hTERTは発現しません。したがって、hTERTは分化細胞におけるテロメラーゼ活性の制限因子として機能します。^{[ 14 ] [ 23 ]}しかし、hTERTを過剰発現させると、分化細胞で活性テロメラーゼを形成できます。この方法は、通常in vitroでの培養が困難な前立腺上皮細胞および間質由来細胞の不死化に使用されています。hTERTの導入により、これらの細胞をin vitroで培養することが可能になり、将来の研究に利用できるようになります。 hTERTの導入は、不死化のためのウイルス性タンパク質の使用に比べて、癌形成につながる可能性のある腫瘍抑制遺伝子の不活性化を伴わないという利点がある。 ^{[ 22 ]}

幹細胞におけるhTERTの過剰発現は細胞の特性を変化させる。^{[ 21 ] [ 24 ]} hTERTの過剰発現はヒト間葉系幹細胞の幹細胞特性を高める。間葉系幹細胞の発現プロファイルは胚性幹細胞に収束しており、これらの細胞が胚性幹細胞のような特性を持つ可能性があることを示唆している。しかし、間葉系幹細胞は自発的分化のレベルが低下することが観察されている。^{[ 21 ]}これは、成体幹細胞の分化能力がテロメラーゼ活性に依存している可能性があることを示唆している。したがって、テロメラーゼ活性の増加に類似したhTERTの過剰発現は、より大きな分化能力、ひいてはより大きな治療能力を持つ成体幹細胞を作り出す可能性がある。

幹細胞におけるテロメラーゼ活性の増加は、異なる種類の幹細胞の固有の性質に応じて異なる効果をもたらします。^{[ 18 ]} したがって、すべての幹細胞が幹細胞特性の増加を示すわけではありません。たとえば、研究により、hTERTの過剰発現によってCD34+臍帯血細胞でテロメラーゼが上方制御されることが示されています。これらの幹細胞の生存は向上しましたが、集団倍加量の増加はありませんでした。^{[ 24 ]}

テロメラーゼ活性は、細胞が分裂できる回数と関連しており、がん細胞などの細胞株の不死化に重要な役割を果たしています。この酵素複合体は、染色体DNAの末端にテロメア反復配列を付加することによって作用します。これにより、不死化がん細胞が生成されます。^{[ 27 ]}実際、テロメラーゼ活性と悪性腫瘍またはがん細胞株の間には強い相関関係があります。^{[ 28 ]}すべてのタイプのヒトがんがテロメラーゼ活性の増加を示すわけではありません。がんの90%はテロメラーゼ活性の増加によって特徴付けられます。^{[ 28 ]}肺がんは、テロメラーゼに関連するがんの中で最もよく特徴付けられているタイプです。^{[ 29 ]}ヒト初代線維芽細胞などの一部の細胞タイプでは、実質的なテロメラーゼ活性が欠如しており、約30～50回の細胞分裂後に老化します。^{[ 28 ]}また、生殖細胞株などの自己複製する組織ではテロメラーゼ活性が増加しているという証拠もあります。一方、正常な体細胞には検出可能なテロメラーゼ活性はありません。 ^{[ 30 ]}テロメラーゼの触媒成分は逆転写酵素hTERT、RNA成分はhTERCであるため、hTERTは癌や腫瘍形成の観点から調査すべき重要な遺伝子です。

hTERT遺伝子は、変異と癌発症リスクとの関連性について研究されてきた。hTERT多型と癌発症の200以上の組み合わせが発見されている。^{[ 29 ]}関与する癌の種類は複数あり、多型と癌発症との相関の強さは弱いものから強いものまで様々であった。^{[ 29 ]}また、癌細胞におけるテロメラーゼ活性化の可能性のあるメカニズムを特定するために、hTERTの調節についても研究されてきた。重要なことに、hTERTプロモーターの変異は最初にメラノーマで同定され、その後、癌における最も一般的な非コード変異であることが示された。^{[ 31 ]}グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3）は、ほとんどの癌細胞で過剰発現しているようである。^{[ 27 ]} GSK3は、転写因子のネットワークを制御することによってプロモーターの活性化に関与している。^{[ 27 ]}レプチンは、シグナル伝達因子および転写活性化因子3（STAT3）を介してhTERTのmRNA発現を増加させることにも関与しており、肥満者における癌発生率増加のメカニズムを示唆している。^{[ 27 ]}癌細胞では、 Rasシグナル伝達経路やその他の転写調節因子など、変化または異常を示す他のいくつかの調節メカニズムが存在する。 ^{[ 27 ]}リン酸化は、mRNA発現と細胞内局在を調節する転写後修飾の重要なプロセスでもある。^{[ 27 ]}明らかに、細胞内にはhTERTおよびテロメラーゼ活性の活性化と抑制の多くの調節メカニズムがあり、癌細胞の不死化の方法を提供している。

テロメラーゼ活性の増加が悪性度と関連している場合、考えられる癌治療には、その触媒成分であるhTERTを阻害して酵素の活性を低下させ、細胞死を引き起こすことが含まれる可能性があります。正常な体細胞はTERTを発現しないため、癌細胞におけるテロメラーゼ阻害は、正常なヒト細胞に影響を与えることなく老化とアポトーシスを引き起こすことができます。 ^{[ 27 ]} hTERTの優性阻害変異体は細胞内のテロメラーゼ活性を低下させる可能性があることがわかっています。 ^{[ 28 ]}これにより、テロメア長が短い細胞でアポトーシスと細胞死が起こり、癌治療にとって有望な結果となりました。^{[ 28 ]}テロメアが長い細胞ではアポトーシスは起こりませんでしたが、致死的な特徴が現れ、テロメアが短縮しました。^{[ 28 ]}テロメラーゼ活性は、イソプレノイド、ゲニステイン、クルクミンなどの植物化学物質によっても阻害されることがわかっています。^{[ 27 ]}これらの化学物質は、リン酸化のダウンレギュレーションを介してmTOR経路を阻害する役割を果たします。^{[ 27 ]} mTOR経路はタンパク質合成の調節において非常に重要であり、テロメラーゼと相互作用してその発現を増加させます。^{[ 27 ]}ヌクレオシド類似体、レチノイン酸誘導体、キノロン系抗生物質、カテキン誘導体など、テロメラーゼ活性を阻害することがわかっている他のいくつかの化学物質は、現在、潜在的な臨床治療オプションとしてテストされています。^{[ 30 ]}アンチセンス療法やRNA干渉など、テロメラーゼを阻害する他の分子遺伝学的方法もあります。^{[ 30 ]}

hTERTペプチド断片は、試験管内でテロメラーゼ陽性腫瘍細胞に対する細胞傷害性T細胞反応を誘導することが示されている。^{[ 32 ]}この反応は樹状細胞によって媒介され、樹状細胞は、 T細胞応答を媒介する樹状​​細胞へのhTERTプラスミドのアデノウイルス形質導入後、 MHCクラスIおよびII受容体上にhTERT関連抗原を提示することができる。^{[ 33 ]}樹状細胞は、hTERTプラスミドが存在する限り、テロメラーゼ活性が検出できない量であっても、テロメラーゼ関連抗原を提示することができる。 ^{[ 34 ]}テロメラーゼ陽性腫瘍細胞に対する免疫療法は、癌研究において有望な分野であり、試験管内およびマウスモデル研究において有効であることが示されている。^{[ 35 ]}

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）は、 4つの因子（ Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc）を導入することで幹細胞のような状態に再プログラムされた体細胞です。 ^{[ 36 ]} iPS細胞は無限に自己複製する能力を持ち、胚盤胞に移植したり奇形腫形成に使用したりすると、3つの胚葉すべてに寄与します。^{[ 36 ]}

iPS細胞株の初期開発は効率的ではなく、体細胞の5%しか幹細胞様の状態に正常に再プログラム化されませんでした。^{[ 37 ]}不死化体細胞（hTERTが上方制御された分化細胞） を使用することで、iPS細胞の再プログラミングは、死細胞を使用した再プログラミングと比較して20倍に増加しました。^{[ 37 ]}

ヒトiPS細胞におけるhTERTの再活性化、それに続くテロメラーゼの活性化は、死細胞を使用した場合、多能性およびES（胚性幹細胞）様状態への再プログラミングの指標として用いられてきた。 ^{[ 36 ]} 十分なhTERTレベルを発現しない再プログラミング細胞は、分化するための幹細胞様能力を維持しながら、テロメアの長さに応じて一定回数の複製後に静止状態に入る。 ^{[ 37 ]} TERT活性の再活性化は、高橋と山中によって記述された4つの再プログラミング因子のうち3つだけを使用して達成できる。具体的には、Oct3/4、Sox2、Klf4は必須であるが、c-Mycは必須ではない。^{[ 16 ]}しかし、この研究は、再プログラミングに十分であった可能性のある内因性レベルのc-Mycを含む細胞で行われた。

健康な成体細胞のテロメア長は、 iPS細胞として再プログラムされると伸長し、 ES細胞と同様のエピジェネティック特性を獲得します。ES細胞のエピジェネティック特性には、テロメアにおけるトリメチル化ヒストンH3K9およびH4K20の密度の低下、ならびに検出可能なTERT転写産物およびタンパク質活性の増加が含まれます。^{[ 16 ]} TERTおよび関連するテロメラーゼタンパク質の回復がなければ、iPS細胞の効率は大幅に低下します。iPS細胞は自己複製能力も失い、最終的には老化します。^{[ 16 ]}

DKC（先天性角化異常症）患者は全員、テロメアの維持に欠陥があり、幹細胞再生に問題が生じるという特徴がある。 ^{[ 17 ]} TERT遺伝子にヘテロ接合変異を持つDKC患者 由来のiPS細胞は、野生型iPS細胞と比較してテロメラーゼ活性が50%低下する。^{[ 38 ]}逆に、hTERT遺伝子が無傷で機能している限り、TERC遺伝子（テロメラーゼ複合体のRNA部分）の変異は、リプログラミングによるアップレギュレーションによって克服できる。 ^{[ 39 ]}最後に、ジスケリン（DKC1）遺伝子に変異を持つDKC細胞から生成されたiPS細胞はhTERT/RNA複合体を組み立てることができず、機能的なテロメラーゼを持たない。^{[ 38 ]}

再プログラムされたiPS細胞の機能性と効率は、細胞がテロメラーゼ複合体を再活性化し、テロメアを伸長させて自己複製を可能にする能力によって決まります。hTERTはテロメラーゼ複合体の主要な制限因子であり、完全なhTERTの欠乏はテロメラーゼの活性を阻害するため、iPS細胞はテロメア欠乏症の治療への適切な経路ではありません。^{[ 38 ]}

メカニズムは完全には解明されていないが、TERT欠損造血細胞をアンドロゲンに曝露すると、TERT活性レベルが上昇する。^{[ 40 ]}通常はTERTの基礎レベルが低いDKC（先天性角化異常症）患者の細胞のように、TERTヘテロ接合変異を 有する細胞は、対照細胞と同等の正常レベルまで回復する可能性がある。アンドロゲンに曝露すると、TERT mRNAレベルも上昇する。^{[ 40 ]}アンドロゲン療法は、 DKCやその他のテロメラーゼ欠損症に関連する骨髄変性や血球減少 などの循環器疾患の治療に適した方法となる可能性がある。 ^{[ 40 ]}

生物が老化し細胞が増殖するにつれて、テロメアは複製ごとに短くなる。特定の系統に限定された細胞は、老化する前にテロメアの長さによって設定された一定回数しか分裂できない。^{[ 41 ]} テロメアの枯渇と脱キャップは、前駆細胞が静止状態になり分化できなくなるため、臓器の変性、機能不全、線維症と関連付けられている。^{[ 20 ] [ 41 ]}生体内のTERT欠損マウスモデルを使用して、複数の臓器の静止集団でTERT遺伝子を再活性化すると、テロメラーゼが再活性化され、細胞の分化能力が回復した。^{[ 42 ]} TERTの再活性化は、細胞の有糸分裂チェックポイントに関連するDNA損傷シグナルを下方制御し、増殖と変性表現型の排除を可能にする。^{[ 42 ]}別の研究では、遺伝子操作されたアデノ随伴ウイルスを用いて健康な1歳のマウスにTERT遺伝子を導入したところ、癌の増加はなく、寿命が24%延長した。^{[ 43 ]}

逆説的ではあるが、白血球テロメア長の延長と関連するTERT遺伝子座の遺伝子変異は、エピジェネティック時計として知られる老化の分子バイオマーカーによると、血液中のエピジェネティック老化速度の加速と関連している。^{[ 44 ]}同様に、ヒトTERTの発現はヒト線維芽細胞におけるエピジェネティック老化を阻止しなかった。^{[ 44 ]}

hTERT遺伝子は、腫瘍細胞では発現するものの成人の体細胞では発現しないため、がんの遺伝子治療において主要な焦点となっている。 ^{[ 45 ]} 一つの方法は、mRNAに結合する相補配列であるsiRNAを導入することでhTERT mRNAの翻訳を阻害し、転写後の遺伝子処理を阻害することである。^{[ 46 ]}この方法はテロメラーゼ活性を 完全に排除するものではないが、テロメラーゼ活性と細胞質で見られるhTERT mRNAのレベルを低下させる。^{[ 46 ]}アンチセンスhTERT配列の使用とPTENなどの腫瘍抑制プラスミドのアデノウイルス感染による導入を組み合わせると、 in vitroで より高い成功率が見られた。^{[ 47 ]}

研究されている別の方法は、hTERTプロモーターを操作して腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することです。プラスミドDNA配列は、hTERTプロモーターに続いて特定のタンパク質をコードする遺伝子を使用して製造できます。タンパク質は、毒素、アポトーシス因子、またはウイルス性タンパク質です。ジフテリア毒素などの毒素は細胞プロセスを妨害し、最終的にアポトーシスを誘導します。^{[ 45 ]} FADD（Fas関連死ドメインタンパク質） などのアポトーシス死因子を使用して、hTERTを発現する細胞にアポトーシスを強制することができます。 ^{[ 48 ]}ウイルス性チミジンキナーゼなどのウイルス性タンパク質は、 薬剤の特定の標的化に使用できます。^{[ 49 ]}ウイルス酵素によってのみ活性化されるプロドラッグを導入することにより、hTERTを発現する細胞の特定の標的化が達成されます。^{[ 49 ]} hTERTプロモーターを使用すると、hTERTを発現する細胞のみが影響を受け、腫瘍細胞の特定の標的化が可能になります。^{[ 45 ] [ 48 ] [ 49 ]}

がん治療以外にも、hTERT遺伝子は毛包の成長を促進するために使用されてきました。^{[ 50 ]}遺伝子治療の模式図を以下に示します。