ポリアクリルアミドゲル電気泳動

試料は、タンパク質または核酸を含むあらゆる物質である。これらは、例えば原核細胞や真核細胞、組織、ウイルス、環境試料、精製タンパク質など、生物学的に由来するものであってもよい。固形組織や細胞の場合、多くの場合、まずブレンダー（試料量が多い場合）、ホモジナイザー（試料量が少ない場合） 、超音波処理装置、または高圧サイクル処理を用いて機械的に粉砕し、電気泳動の前に、様々な種類のろ過や遠心分離を含む生化学的および機械的手法を組み合わせて、異なる細胞区画や細胞小器官を分離する。オリゴヌクレオチドなどの合成生体分子も分析対象物として使用できる。

分析するサンプルは、必要に応じて化学変性剤と混合されます。通常、タンパク質の場合はSDS、核酸の場合は尿素が使用されます。SDSは陰イオン界面活性剤で、二次構造およびジスルフィド結合していない三次構造を変性させ、さらに各タンパク質に質量に比例した負電荷を与えます。尿素は核酸の塩基対間の水素結合を切断し、構成鎖を分離させます。サンプルを少なくとも60  ℃まで加熱すると、変性がさらに促進されます。^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}

SDSに加えて、タンパク質は、ジチオスレイトール（DTT）や2-メルカプトエタノール（β-メルカプトエタノール/BME）などの還元剤の存在下で、沸騰直前まで短時間加熱される場合もある。これにより、ジスルフィド結合が還元されてタンパク質がさらに変性し、タンパク質の三次構造の一部が解消され、四次構造（オリゴマーサブユニット）が破壊される。これは還元SDS-PAGEとして知られている。

溶液に追跡用色素を添加することがある。この色素は通常、分析対象物よりも電気泳動移動度が高く、実験者が電気泳動中にゲル内での溶液の進行状況を追跡できるようにする。

ゲルは通常、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、オプションの変性剤（SDSまたは尿素）、およびpH調整された緩衝液から構成されます。重合中に気泡が発生するのを防ぐため、溶液を真空下で脱気することができます。あるいは、ブタノールは気泡を除去して表面を滑らかにするため、ゲル（タンパク質用）を注いだ後にブタノールを加えることもできます。 ^{[ 12 ]}重合を開始するために、フリーラジカル源と安定剤（過硫酸アンモニウムやTEMEDなど）が添加されます。^{[ 13 ]}重合反応によりゲルが生成されるのは、添加されたビスアクリルアミドが2つのアクリルアミド分子間に架橋を形成できるためです。ビスアクリルアミドとアクリルアミドの比率は特別な目的に合わせて変更できますが、一般的には1：35程度です。ゲルのアクリルアミド濃度も変更でき、一般的には5%から25%の範囲です。低濃度のゲルは、非常に分子量の大きい分子の分離に適していますが、より小さなタンパク質を分離するには、はるかに高い濃度のアクリルアミドが必要です。ポリアクリルアミドゲルの平均細孔径は、アクリルアミドの総濃度（T = アクリルアミドとビスアクリルアミドの総濃度、%T）と架橋剤ビスアクリルアミドの濃度（C = ビスアクリルアミド濃度、%C）によって決まります。^{[ 14 ]}細孔サイズは、%T に反比例して小さくなります。%C に関しては、ビスアクリルアミドが細孔サイズに及ぼす影響は、頂点が 5% の放物線状であるため、5% の濃度で最小の細孔が生成されます。

ゲルは通常、ゲルキャスター内で2枚のガラス板の間に挟んで重合され、上部にコームを挿入してサンプルウェルを形成します。ゲルが重合したらコームを取り外し、ゲルは電気泳動の準備が整います。

PAGEでは、サンプルの性質や実験目的に応じて様々なバッファーシステムが使用されます。陽極と陰極で使用されるバッファーは同じ場合もあれば、異なる場合もあります。^{[ 10 ] [ 15 ] [ 16 ]}

ゲルに電場を印加すると、負に帯電したタンパク質や核酸が、負極（ガルバニ電池ではなく電解セルであるため陰極）から離れて正極（陽極）に向かってゲル内を移動します。生体分子はサイズによってゲルマトリックス内を異なる速度で移動します。小さな分子はゲルの細孔を容易に通過できますが、大きな分子は通過しにくくなります。ゲル電気泳動は通常数時間行われますが、これはゲルに印加する電圧によって異なります。電圧が高いほど移動速度は速くなりますが、その結果は一般的に低電圧の場合よりも精度が低くなります。一定時間経過後、生体分子はサイズに応じて異なる距離を移動します。小さな生体分子はゲル内をより遠くまで移動し、大きな生体分子は元の位置にとどまります。したがって、生体分子はサイズに基づいて大まかに分離できます。サイズは主に変性条件下での分子量に依存しますが、天然条件下での高次構造にも依存します。ゲル移動度は、1V/cmの電圧勾配で移動した速度として定義され、単位はcm²/秒/Vである^。 [ ^{4 ] ： 161-3分析}目的では、生体分子の相対移動度Rf _（ゲル上で分子が移動した距離と追跡色素の全移動距離の比）を、分子の分子量（またはMWの対数、あるいは分子半径Mr）に対してプロットする_。このような典型的な直線プロットは、様々な生体分子サイズの定量的推定に広く用いられる標準マーカーまたは検量線を表す。^{[ 4 ]： 161-3}

しかしながら、特定の糖タンパク質はSDSゲル上で異常な挙動を示す。さらに、250,000～600,000 Daのより大きなタンパク質の分析も、そのようなポリペプチドが通常使用されるゲルシステムで不適切に移動するため問題があると報告されている。^{[ 17 ]}

Following electrophoresis, the gel may be stained (for proteins, most commonly with Coomassie brilliant blue R-250 or autoradiography; for nucleic acids, ethidium bromide; or for either, silver stain), allowing visualization of the separated proteins, or processed further (e.g. Western blot). After staining, different species biomolecules appear as distinct bands within the gel. It is common to run molecular weight size markers of known molecular weight in a separate lane in the gel to calibrate the gel and determine the approximate molecular mass of unknown biomolecules by comparing the distance traveled relative to the marker.

For proteins, SDS-PAGE is usually the first choice as an assay of purity due to its reliability and ease. The presence of SDS and the denaturing step make proteins separate, approximately based on size, but aberrant migration of some proteins may occur. Different proteins may also stain differently, which interferes with quantification by staining. PAGE may also be used as a preparative technique for the purification of proteins. For example, preparative native PAGE is a method for separating native metalloproteins in complex biological matrices.^[18]

ポリアクリルアミドゲルは、スタッキングゲルと分離ゲルから構成されています。スタッキングゲルは分離ゲルに比べて多孔性が高く、タンパク質が濃縮された領域に移動できます。さらに、スタッキングゲルは通常pHが6.8で、中性のグリシン分子がタンパク質の移動を速めます。分離ゲルはpHが8.8で、陰イオン性のグリシンがタンパク質の移動を遅くします。分離ゲルはタンパク質の分離を可能にし、多孔性は比較的低くなっています。ここでは、タンパク質はサイズ（SDS-PAGE）とサイズ/電荷（ネイティブPAGE）に基づいて分離されます。^{[ 22 ]}

化学緩衝液は、ゲル自体および電気泳動緩衝液中のpH値を所望の値に安定させます。緩衝液の選択は、緩衝液の対イオンの電気泳動移動度にも影響し、ひいてはゲルの分離度にも影響します。緩衝液は、ほとんどのタンパク質を修飾または反応させない、非反応性である必要があります。用途に応じて、陰極緩衝液と陽極緩衝液としてそれぞれ異なる緩衝液が使用される場合があります。例えば、DISC電気泳動では、1つのゲル内で複数のpH値が使用される場合があります。PAGEで一般的に使用される緩衝液には、Tris、Bis-Tris、またはイミダゾールなどがあります。

対イオンは緩衝液イオンの固有電荷を相殺し、電気泳動中の電場強度にも影響を与えます。高電荷で移動性の高いイオンはSDS-PAGE陰極緩衝液では避けられることが多いですが、ゲル自体には含まれ、タンパク質より先に移動することがあります。DISC SDS-PAGEなどのアプリケーションでは、ゲル内のpH値を変化させて、泳動中の対イオンの平均電荷を変化させ、分解能を向上させることがあります。よく使われる対イオンはグリシンとトリシンです。グリシンは、pKaが9.69であり、グリシン酸塩の移動度が、有効移動度をpH範囲内で最も遅い正味負電荷を持つ既知のタンパク質の移動度よりも低い値に設定できるため、トレーリングイオンまたはスローイオンの供給源として使用されてきました。この範囲の最小pHは約8.0です。

Acrylamide (C₃H₅NO; mW: 71.08) when dissolved in water, slow, spontaneous autopolymerization of acrylamide takes place, joining molecules together by head on tail fashion to form long single-chain polymers. The presence of a free radical-generating system greatly accelerates polymerization. This kind of reaction is known as vinyladdition polymerisation. A solution of these polymer chains becomes viscous but does not form a gel, because the chains simply slide over one another. Gel formation requires linking various chains together. Acrylamide is carcinogenic,^[23] a neurotoxin, and a reproductive toxin.^[24] It is also essential to store acrylamide in a cool dark and dry place to reduce autopolymerisation and hydrolysis.

Bisacrylamide (N,N′-methylenebisacrylamide) (C₇H₁₀N₂O₂; mW: 154.17) is the most frequently used cross linking agent for polyacrylamide gels. Chemically it can be thought of as two acrylamide molecules coupled head to head at their non-reactive ends. Bisacrylamide can crosslink two polyacrylamide chains to one another, thereby resulting in a gel.

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（C ₁₂ H ₂₅ NaO ₄ S ; mW: 288.38）（タンパク質ゲルの変性にのみ使用）は、天然タンパク質を個々のポリペプチドに変性させるために使用される強力な界面活性剤です。再構成変性と呼ばれるこの変性は、タンパク質の完全な線状化によって達成されるのではなく、ランダムコイルとαヘリックスの二次構造の組み合わせへのコンフォメーション変化によって達成されます。^{[ 7 ]}タンパク質混合物をSDSの存在下で100℃に加熱すると、界面活性剤はポリペプチドの主鎖に巻き付きます。これは、ポリペプチド1gあたり1.4gのSDSという一定の重量比でポリペプチドに結合します。このプロセスでは、ポリペプチドの固有電荷は、SDSによってもたらされる負電荷と比較すると無視できるほど小さくなります。したがって、処理後のポリペプチドは、均一な電荷密度、つまり単位重量あたり同じ正味の負電荷を持つ棒状構造になります。これらのタンパク質の電気泳動移動度は、分子量の対数の線形関数です。SDSがない場合、分子量が似ている異なるタンパク質は、質量電荷比の違いにより移動度が異なります。これは、各タンパク質がそれぞれの一次構造に固有の等電点と分子量を持っているためです。これはネイティブPAGEとして知られています。SDSを加えることで、タンパク質に結合して折り畳みを解除し、ポリペプチド鎖の長さに沿ってほぼ均一な負電荷を与えるため、この問題が解決されます。 

尿素（CO(NH ₂ ) ₂ ; mW: 60.06）は、水素結合やファンデルワールス力などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨害することにより、系のエントロピーを増加させるカオトロピック剤である。高分子構造はこれらの力の正味の効果に依存するため、カオトロピック溶質の増加は高分子を変性させる。

過硫酸アンモニウム（APS）（N₂H₈S₂O₈ ；_分子量： 228.2）はフリーラジカルの発生源であり、ゲル形成の開始剤としてよく用いられる。フリーラジカルの代替発生源としてはリボフラビンがあり、これ_は光化学反応によってフリーラジカルを生成する。

N , N , N ′, N′-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）（ C6H16N2 ；分子量：_{116.21 ）}はフリーラジカルを安定化させ、重合を促進します。重合速度と得られるゲルの特性は_、フリーラジカルの濃度に依存します。フリーラジカルの量を増やすと、平均ポリマー鎖長が減少し、ゲルの濁度が増加し、ゲルの弾性が低下します。量を減らすと、逆の効果が現れます。妥当な時間内に重合が進行する最低の触媒濃度を使用する必要があります。APSとTEMEDは通常、1～10 mMの範囲でほぼ等モル濃度で使用されます。

ゲルおよびゲル中に可視化されたタンパク質サンプルの処理には、以下の化学物質および手順が使用されます。

トラッキング色素：タンパク質や核酸はほとんど無色であるため、電気泳動中のゲル内での移動を容易に追跡することはできません。そのため、既知の電気泳動移動度を持つ陰イオン性色素が通常PAGEサンプルバッファーに添加されます。非常に一般的なトラッキング色素は、ブロモフェノールブルー（BPB、3',3",5',5"テトラブロモフェノールスルホンフタレイン）です。この色素はアルカリ性および中性pHで着色し、陽極に向かって移動する小さな負電荷分子です。移動度が高いため、ほとんどのタンパク質よりも先に移動します。電気泳動媒体の陽極側に到達すると、電気泳動は停止します。この色素は一部のタンパク質に弱く結合し、青色を呈します。その他の一般的なトラッキング色素としては、移動度が低いキシレンシアノールと、移動度が高いオレンジGがあります。

ローディング補助剤：ほとんどのPAGEシステムでは、ゲル内のウェルにサンプルを上部からロードします。サンプルがウェルの底に沈むように、サンプルバッファーにはサンプルの密度を高める添加剤が加えられます。これらの添加剤は、電気泳動を妨害しないように、非イオン性でタンパク質と反応しないものでなければなりません。一般的な添加剤としては、グリセロールとスクロースがあります。

クーマシーブリリアントブルー_R -250（CBB）（C45H44N3NaO7S2 ；分子_量： 825.97 ）は_{、最も一般的なタンパク質染色剤です。これは陰イオン性色素で}、タンパク質に非特異的に結合します。CBBの構造は主に非極性であり、通常は酢酸で酸性化したメタノール溶液で使用されます。ゲル中のタンパク質は酢酸によって固定され、同時に染色されます。ゲルに取り込まれた過剰な色素は、色素を含まない同じ溶液で脱色することで除去できます。タンパク質は透明な背景上に青色のバンドとして検出されます。SDSも陰イオン性であるため、染色プロセスに干渉する可能性があります。したがって、ゲルの体積の少なくとも10倍の量の染色液を使用することが推奨されます。

エチジウムブロミド（EtBr）は、一般的な核酸染色剤です。EtBrは紫外線照射下でオレンジ色に蛍光を発するため、ゲル上でDNAやRNAを容易に可視化できます。^{[ 25 ]}エチジウムブロミドはインターカレーションによって核酸鎖に結合します。^{[ 4 ]}エチジウムブロミドは一般的な染色剤ですが、EtBrは既知の発がん物質であるため、使用には注意が必要です。そのため、多くの研究者は、 EtBrよりも安全な代替品であるSYBR GreenやSYBR Safeなどの染色剤を使用することを選択しています。^{[ 26 ]} EtBrは、ゲル混合物に加えるだけで使用できます。ゲルが泳動したら、写真記録システムを使用してゲルを観察できます。^{[ 4 ]}

銀染色法は、より高感度な検出方法が必要な場合に使用されます。従来のクーマシーブリリアントブルー染色法では、通常50  ngのタンパク質バンドを検出できますが、銀染色法では感度が通常10～100倍向上します。これは写真現像の化学に基づいています。タンパク質は希釈メタノール溶液でゲルに固定され、その後酸性硝酸銀溶液でインキュベートされます。銀イオンはアルカリ性pHでホルムアルデヒドによって金属イオンに還元されます。酢酸などの酸性溶液は現像を停止します。^{[ 27 ]}銀染色法は、ゲル中の微量のタンパク質を検出するための高感度な手順として、ケレニとガリヤスによって導入されました。^{[ 28 ]}この技術は、さまざまな支持体で分離された他の生物学的高分子の研究に拡張されています。 ^{[ 29 ]}色の強度に影響を与える変数は多く、すべてのタンパク質には独自の染色特性があります。清潔なガラス器具、純粋な試薬、最高純度の水が染色を成功させるための鍵となります。^{[ 30 ]}銀染色法は、ガラスの表面を着色するために14世紀に開発されました。16世紀以降、この目的で広く使用されています。初期の銀染色法で得られる色は、淡黄色から橙赤色まででした。カミッロ・ゴルジは、神経系の研究のために銀染色法を完成させました。ゴルジ法は、限られた数の細胞を無作為に完全に染色します。^{[ 31 ]}

オートラジオグラフィーは、ゲル電気泳動後のタンパク質バンドの検出にも使用され、放射性同位体を用いてタンパク質を標識し、その後X線フィルムを用いて検出する。^{[ 32 ]}

ウェスタンブロッティングとは、アクリルアミドゲルで分離されたタンパク質を、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜などの安定で操作可能な膜に電気泳動的に転写するプロセスです。その後、免疫化学的手法を用いて転写されたタンパク質を可視化し、目的タンパク質の相対的な増減を正確に特定することが可能になります。