核酸のゲル電気泳動

核酸のゲル電気泳動は、DNAまたはRNA の断片をサイズと反応性で分離する分析技術です。核酸分子をゲル上に置くと、電界によって核酸 (糖リン酸骨格のため負に帯電) が正に帯電した陽極に向かって移動します。分子は、各分子のサイズと形状に基づいてゲル内を移動しながら分離します。長い分子は、短い分子よりもゲルの抵抗が大きいため、ゆっくりと移動します。しばらくすると、電気がオフになり、さまざまな分子の位置が分析されます。

分離する核酸は、電気泳動による分離の前に、いくつかの方法で準備できます。大きな DNA 分子の場合、DNA は DNA 制限エンドヌクレアーゼ (または制限酵素) を使用して小さな断片に切断されることがよくあります。PCR 増幅サンプルなどの他の例では、分子の分離に影響を与える可能性のあるサンプル内の酵素は、分析前にさまざまな方法で除去されます。核酸が適切に準備されると、核酸溶液のサンプルがゲルのウェルに配置され、指定された時間、ゲル全体に電圧が印加されます。

異なる長さの DNA 断片は、エチジウム ブロマイドなどの DNA に特有の蛍光染料を使用して視覚化されます。ゲルには、異なる分子量を持つ異なる核酸分子集団に対応するバンドが表示されます。断片のサイズは通常、「ヌクレオチド」、「塩基対」、または「kb」(数千塩基対) で報告されます。これは、一本鎖または二本鎖の核酸が分離されたかどうかによって異なります。断片のサイズの決定は、通常、既知の長さの線状 DNA 断片を含む市販のDNA マーカーと比較して行われます。

核酸電気泳動に最も一般的に使用されるゲルの種類は、アガロース（比較的長い DNA 分子用）とポリアクリルアミド（DNA 配列決定などの短い DNA 分子の高解像度用）です。ゲルは従来、図に示すような「スラブ」形式で泳動されてきましたが、ハイスループット DNA 配列決定などの用途ではキャピラリー電気泳動が重要になってきました。DNA損傷の評価に使用される電気泳動技術には、アルカリゲル電気泳動とパルスフィールドゲル電気泳動があります。

20～60bpの二本鎖DNAなどの短いDNAセグメントの場合、ポリアクリルアミドゲル（PAGE）で泳動すると解像度が向上します（ネイティブ状態）。^[1]同様に、RNAと一本鎖DNAは、尿素などの変性剤を含むPAGEゲルで泳動して視覚化できます。PAGEゲルは、 DNAフットプリント、 EMSA、その他のDNA-タンパク質相互作用技術 などの技術で広く使用されています。

測定と分析は、主に専用のゲル分析ソフトウェアを使用して行われます。キャピラリー電気泳動の結果は通常、エレクトロフェログラムと呼ばれるトレース ビューに表示されます。

核酸の移動には、ゲル細孔の大きさ、使用される電圧、緩衝液のイオン強度、電気泳動中に使用されるエチジウムブロマイドなどの挿入色素の濃度など、さまざまな要因が影響します。 ^[2]

ゲルは DNA を DNA 分子の大きさでふるいにかけるため、小さい分子の方が速く移動します。二本鎖 DNA は、塩基対数の対数にほぼ反比例する速度で移動します。ただし、この関係は非常に大きな DNA 断片では崩れ、標準的なアガロースゲル電気泳動では分離できません。分解能の限界は、ゲルの組成と電界強度に依存します。^[3]また、大きな環状 DNA の移動度は、線状 DNA よりもゲルの細孔サイズの影響を強く受ける場合があります。^[4] 非常に大きな DNA 断片の分離には、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE) が必要です。フィールド反転ゲル電気泳動 (FIGE、PFGE の一種) では、「バンド反転」が発生する可能性があります。これは、大きな分子が小さな分子よりも速く移動する可能性があることを意味します。

DNA分子の立体配座はDNAの動きに大きく影響します。例えば、スーパーコイルDNAは、しっかりとコイル状になっており、よりコンパクトなため、通常、緩和DNAよりも速く動きます。通常のプラスミドDNA調製物では、複数の形態のDNAが存在する可能性があり、^[5]プラスミドの電気泳動からのゲルは通常、負のスーパーコイル形態であるメインバンドを示し、他の形態のDNAはより薄いマイナーバンドとして現れることがあります。これらのマイナーバンドは、ニックDNA（開環状形態）と、通常スーパーコイルDNAよりも遅く移動する緩和した閉環状形態である可能性があり、一本鎖形態（調製方法によっては時々現れる）はスーパーコイルDNAより先に移動する可能性があります。ただし、さまざまな形態の移動速度は、異なる電気泳動条件を使用して変化する可能性があります。例えば、線状DNAは、条件に応じてスーパーコイルDNAよりも速くまたは遅く移動する可能性があります^[6]また、より大きな環状DNAの移動度は、線状DNAよりもゲルの細孔サイズの影響を強く受ける可能性があります。^{[4]超らせん}DNAマーカーを使用しない 限り、制限酵素消化によって直線化された後の方が、環状DNAのようなプラスミドのサイズをより正確に測定できる可能性がある。

架橋の増加によるDNA損傷は、用量依存的に電気泳動によるDNAの移動を減少させる。^{[7] [8]}

電気泳動中にゲル内にエチジウムブロマイドが存在する場合、環状 DNA は線状 DNA よりもエチジウムブロマイド濃度の影響をより強く受けます。自然に発生するすべての DNA 環状構造は内側に巻かれていますが、環状 DNA に挿入されるエチジウムブロマイドは DNA 分子の電荷、長さ、超らせん構造を変化させることができるため、電気泳動中に存在するとゲル内での動きが影響を受ける可能性があります。DNA に挿入されるエチジウムブロマイドが増加すると、DNA は負の超らせん分子から完全に緩和した形に変化し、次に最大挿入時には正の超らせん構造に変化します。^[9]アガロースゲル電気泳動は、異なる超らせん構造の環状 DNA を分離するために使用できます。

ゲルの濃度によってゲルの細孔サイズが決まり、これが DNA の移動に影響します。DNA の分解能はゲルの濃度のパーセンテージによって変わります。ゲルのアガロース濃度を上げると移動速度が遅くなり、小さな DNA 分子の分離が改善されますが、ゲル濃度を下げると大きな DNA 分子を分離できるようになります。標準的なアガロース ゲル電気泳動では、0.7% のゲル濃度で 5～10kb の大きな DNA 断片の分離または分解能が良好になり、2% のゲル濃度では 0.2～1kb の小さな断片の分解能が良好になります。非常に小さな断片の分離には最大 3% のゲル濃度を使用できますが、小さな断片の分離には垂直ポリアクリルアミド ゲルの方が適しています。ただし、高濃度ゲルでは実行時間が長くなり (場合によっては数日)、高濃度ゲルはもろくなり、均一に固まらないことがあります。高濃度アガロース ゲルは PFGE または FIGE で実行する必要があります。低濃度ゲル (0.1～0.2%) は壊れやすく、破損する可能性があります。 1%ゲルは多くの用途で一般的です。^[10]

低電圧では、DNAの移動速度は印加電圧に比例します。つまり、電圧が高いほど、DNAの移動速度が速くなります。しかし、電界強度が増加すると、高分子量のDNA断片の移動度が差別的に増加し、分離の有効範囲が減少し、したがって高電圧での分解能が低下します。標準的なゲル電気泳動で2kbを超えるサイズのDNAを最適に分離するには、5～8V/cmが推奨されます。^[6] また、電圧はゲルを加熱し、特に低融点アガロースゲルの場合、ゲルを長時間高電圧で流すとゲルが溶ける可能性があるため、電圧には制限があります。

しかし、DNAの移動度は不安定な磁場の中で変化する可能性がある。周期的に反転する磁場の中では、特定のサイズのDNAの移動度は特定のサイクル周波数で大幅に低下する可能性がある。^[11] この現象によりバンド反転が起こり、PFGEでは大きなDNA断片が小さな断片よりも速く移動する。

リン酸骨格の負電荷により、電気泳動中、DNAは正電荷を帯びた陽極に向かって移動します。しかし、ゲルマトリックスがない場合、溶液中のDNA分子の移動は電気泳動中の分子量とは無関係です。つまり、ゲルマトリックスがなければサイズによる分離はありません。^[12] DNAの異なる部分間の流体力学的相互作用は、反対方向に移動する対イオンの流動によって遮断されるため、約10 nmのスクリーニング長さよりも大きなスケールで速度の長さへの依存性を生成するメカニズムは存在しません。^[11]これが、長距離の流体力学的相互作用が重要な沈降や拡散などの他のプロセスとは異なります。

したがって、ゲルマトリックスは電気泳動中に DNA をサイズ別に分離する役割を果たしますが、分離の正確なメカニズムは完全には明らかではありません。ゲルマトリックス内の生体分子の分離メカニズムについてはいくつかのモデルが存在し、広く受け入れられているのは、ポリマーマトリックスを、相互接続された細孔のランダムに分布したネットワークで構成されるふるいとして扱うオグストンモデルです。^[13]球状タンパク質またはランダムコイルDNA は、通過できる大きさの連結された細孔を通過しますが、より大きな分子の動きはゲルマトリックスとの衝突によって妨げられ、遅くなる可能性が高く、したがって、このふるい分けのプロセスで異なるサイズの分子が分離されます。^[11]

しかし、オグストンモデルは、孔が分子のサイズよりも大幅に小さい大きな分子では破綻します。1 kb を超えるサイズの DNA 分子の場合、レプテーションモデル (またはその変種) が最も一般的に使用されます。このモデルは、DNA が細長い分子として孔を「蛇のように」這うことができる (したがって「レプテーション」) ことを想定しています。電界強度が高くなると、これはバイアスレプテーションモデルに変わり、分子の先端が前方に強くバイアスされ、この先端が分子の残りの部分を引っ張ります。完全にバイアスされたモードでは、移動度が飽和点に達し、特定のサイズを超える DNA は分離できません。^[13] ただし、チェーンと電界が完全に平行に並ぶことは実際には観察されません。これは、長い分子と短い分子の移動度が同じになることを意味するためです。^[11]バイアスレプテーションモデルのさらなる改良では、チェーンの内部変動を考慮します。^[14]

偏向レプテーションモデルは、PFGEにおけるDNAの移動性を説明するためにも使用されている。DNAの配向は、磁場の開始後にレプテーションによって徐々に構築され、定常速度に達する時間は分子のサイズに依存する。磁場が変化すると、大きな分子は再配向に時間がかかるため、定常速度に達することができない長い鎖と、ほとんどの時間定常速度で移動する短い鎖を区別することが可能になる。^[14] ただし、他のモデルも存在する。

染色された分子のリアルタイム蛍光顕微鏡検査では、電気泳動中にDNAがかなり弾力性を示し、印加された電場の方向に伸びたり、球状に収縮したり、ポリマー繊維に引っかかったときにU字型に引っかかったりすることが示された。^{[15] [16]} この観察結果は「キャタピラー」モデルと呼ばれることがある。^[17]他のモデルでは、DNAがポリマーマトリックスと絡み合い、分子が大きいほど絡み合いやすくなり、動きが妨げられると提案されている。^[18]

アガロースゲル電気泳動で DNA または RNA バンドを可視化するために最も一般的に使用される染料は、エチジウムブロマイド（通常 EtBr と略される）である。これは、DNA（または RNA）の主溝に挿入されると紫外線下で蛍光を発する。DNA を EtBr 処理したゲルに通し、紫外線で可視化すると、約 20 ng を超える DNA を含むバンドがはっきりと見えるようになる。EtBr は既知の変異原性物質^[19]であり、副溝に結合する Biotium 社製のGelRedなど、より安全な代替品が利用可能である。^[20]

SYBR Green Iは、 Invitrogen社が製造する別のdsDNA染色剤です。より高価ですが、EtBrの25倍の感度があり、おそらくより安全ですが、ヒトに対する変異原性や毒性に関するデータはありません。^[21]

SYBR SafeはSYBR Greenの変種であり、変異原性と毒性のレベルが低いことが示されており、米国連邦規制の下では非有害廃棄物とみなされています。^[22] EtBrと同等の感受性レベルを持っていますが、^[22] SYBR Greenと同様に、大幅に高価です。ただし、有害廃棄物の安全な処分が義務付けられている国では、EtBrの処分コストが当初の価格差を簡単に上回ることがあります。

EtBr で染色した DNA は自然光では見えないため、科学者は DNA を負に帯電したローディング バッファーと混合してからゲルに混合物を加えます。ローディング バッファーは自然光で見える (EtBr で染色した DNA の場合は UV 光で見える) ため、また DNA と共沈する (つまり、特定の長さの DNA と同じ速度で移動する) ため便利です。キシレン シアノールとブロモフェノール ブルーはローディング バッファーに含まれる一般的な染料です。これらはそれぞれ 5000 bp と 300 bp の長さの DNA 断片とほぼ同じ速度で移動しますが、正確な位置はゲルの割合によって異なります。あまり使用されない他の進行マーカーにはクレゾール レッドとオレンジ Gがあり、それぞれ約 125 bp と 50 bp で移動します。

SDS-PAGE後に DNA をニトロセルロース膜に転写し、ハイブリダイゼーションプローブにさらすことによっても可視化できます。このプロセスはサザンブロッティングと呼ばれます。

蛍光色素の場合、電気泳動後、ゲルを紫外線ランプで照射します（通常はライトボックスの上に置き、紫外線への曝露を制限するために保護具を着用します）。照射装置には、ほとんどの場合、紫外線照射後のゲルの画像を取得する画像撮影装置も含まれています。エチジウムブロマイドは、 DNAとインターカレーションされているため、DNAが存在すると赤橙色の 蛍光を発します。DNAバンドをゲルから切り取ることもでき、その後溶解して精製DNAを取り出すことができます。その後、ゲルを通常はデジタルカメラまたはポラロイドカメラで撮影します。染色された核酸は赤橙色の蛍光を発しますが、画像は通常白黒で表示されます（図を参照）。DNAサンプルへの紫外線損傷は、ライゲーションやクローニングなど、サンプルのその後の操作の効率を低下させる可能性があります。より短い波長の紫外線（302または312 nm）はより大きな損傷を引き起こし、たとえば45秒の曝露でも形質転換効率が大幅に低下する可能性があります。したがって、DNAを下流の手順で使用する場合は、より短波長の紫外線への曝露を制限し、代わりにダメージの少ないより高波長の紫外線（365 nm）を使用する必要があります。ただし、波長の長い放射線は蛍光が弱くなるため、ゲル画像をキャプチャする必要がある場合は、より短波長の紫外線を短時間使用できます。シチジンまたはグアノシンを1 mMの濃度で電気泳動バッファーに追加すると、DNAを損傷から保護できます。^{[23]代わりに、} SYBR GreenやGelGreenなどの青色励起染色を備えた青色光励起源を使用することもできます。

ゲル電気泳動研究では、 ImageJなどのソフトウェアベースの画像解析ツールが活用されることが多いです。