二次元ゲル電気泳動

2次元ゲル電気泳動（ 2-DEまたは2D電気泳動とも略される）は、タンパク質の分析によく使用されるゲル電気泳動の一種です。タンパク質の混合物は、2Dゲル上で2次元的に2つの特性によって分離されます。2-DEは、1975年にO'Farrell ^[1]とKlose ^[2]によって初めて独立して導入されました。

分離の根拠

2 次元電気泳動は、第 1 次元の電気泳動から始まり、次に分子を第 1 次元から垂直に分離して、第 2 次元の電気泳動図を作成します。第 1 次元の電気泳動では、分子は等電点に従って直線的に分離されます。第 2 次元では、分子は分子量に従って最初の電気泳動図から 90 度に分離されます。2 つの分子が 2 つの異なる特性で類似している可能性は低いため、分子は 1 次元電気泳動よりも 2 次元電気泳動でより効率的に分離されます。^{[引用が必要]}

この技術を使用してタンパク質を分離する 2 つの次元は、等電点、天然状態のタンパク質複合体の質量、またはタンパク質の質量です。^{[引用が必要]}

等電点による分離は等電点電気泳動と呼ばれます。これにより、ゲルに pH 勾配が適用され、ゲル全体に電位が加えられ、一方の端がもう一方の端よりも正になります。等電点以外のすべての pH 値では、タンパク質は帯電します。タンパク質が正に帯電している場合は、ゲルのより負の端に引き寄せられ、負に帯電している場合は、ゲルのより正の端に引き寄せられます。第 1 次元に適用されたタンパク質はゲルに沿って移動し、等電点、つまりタンパク質全体の電荷が 0 (中性電荷) になる点に集まります。
タンパク質複合体の質量による分離はネイティブ PAGE によって行われます。ネイティブ PAGEでは、タンパク質はネイティブな状態のまま、それぞれタンパク質の質量と複合体の質量に従って電場で分離されます。IEF のように正味電荷ではなくサイズによる分離を行うには、クマシーブリリアントブルーまたはドデシル硫酸リチウムを使用して、タンパク質に追加の電荷を移します。タンパク質はほとんどの場合複合体で一緒に作用して完全に機能するため、タンパク質複合体の知識は細胞内のタンパク質の機能の分析に重要です。細胞のこの小器官組織の分析には、タンパク質複合体のネイティブな状態を維持する技術が必要です。
質量のみによる分離は、通常、SDS-PAGE を使用して実現されます。SDSはタンパク質を変性させ、ほとんどの複合体を分解し、質量電荷比をほぼ均等にします。SDS は複合体を分解し (ネイティブ PAGE を不可能にする)、質量電荷比を均等にする (IEF を不可能にする) ため、2 番目の垂直次元として実行する必要があります。

タンパク質の検出

その結果、ゲルの表面にタンパク質が広がる。これらのタンパク質はさまざまな方法で検出できるが、最も一般的に使用される染色は銀染色とクマシーブリリアントブルー染色である。前者の場合、銀コロイドがゲルに塗布される。銀はタンパク質内のシステイン基に結合し、紫外線にさらされると銀が暗くなる。銀の量は暗さと関連しており、したがってゲル上の特定の場所のタンパク質の量と関連している可能性がある。この測定ではおおよその量しか得られないが、ほとんどの目的には十分である。銀染色はクマシーブリリアントブルーよりも100倍感度が高く、直線性の範囲は40倍である。^[3]

タンパク質以外の分子は、2D電気泳動によって分離できます。スーパーコイルアッセイでは、コイル状のDNAを1次元目で分離し、2次元目でDNAインターカレーター（エチジウムブロマイドや発がん性の低いクロロキンなど）によって変性させます。これは、タンパク質分離におけるネイティブPAGE/SDS-PAGEの組み合わせに匹敵します。^{[引用が必要]}

一般的なテクニック

IPG-DALT

一般的な技術は、一次元目に固定化 pH 勾配(IPG)を使用することです。この技術はIPG-DALTと呼ばれます。サンプルは最初に IPG ゲル (市販) 上で分離され、次にゲルは各サンプルごとにスライスに切断され、その後 SDS-メルカプトエタノールで平衡化され、二次元目での分離のためにSDS-PAGEゲルに適用されます。通常、IPG-DALT は、SDS-PAGE ゲルへの転写中に低分子量成分が失われるため、タンパク質の定量には使用されません。^[4]

IEF SDSページ

等電点電気泳動を参照

2Dゲル解析ソフトウェア

定量的プロテオミクスでは、これらのツールは主に個々のタンパク質を定量化し、2-DEゲルのスキャン画像上の1つまたは複数のタンパク質「スポット」間の分離を表示することでバイオマーカーを分析します。さらに、これらのツールは類似サンプルのゲル間のスポットを一致させて、たとえば病気の初期段階と進行段階のプロテオームの違いを示します。ソフトウェアパッケージには、Delta2D（廃止）、ImageMaster（廃止）、Melanie、PDQuest（廃止）、SameSpots、REDFINなどがあります。^[要出典] この技術は広く利用されていますが、そのインテリジェンスは完成されていません。たとえば、PDQuestとSameSpotsは、明確に区別されたタンパク質スポットの定量化と分析では一致する傾向がありますが、明確で区別されていないスポットでは異なる結果と分析傾向を示します。^[5]研究者が分析に「最適な」ソフトウェアを選択するためのガイドとして、以前に比較研究が発表されています。^{[6] Sciugoは標準的な}ゲル電気泳動によく使用されますが、図の作成や定量化にも使用できます。^[要出典]

自動ソフトウェアベースの分析の課題としては、不完全に分離された（重なり合った）スポット（定義が不十分または分離している）、弱いスポット/ノイズ（例：「ゴーストスポット」）、ゲル間の差異（例：タンパク質が異なるゲル上の異なる位置に移動する）、一致しない/検出されないスポットによる欠損値、^[7]^[8]の不一致スポット、定量化のエラー（複数の異なるスポットがソフトウェアによって誤って単一のスポットとして検出され、スポットの一部が定量化から除外される可能性がある）、ソフトウェアアルゴリズムの違い、およびそれによる分析傾向の違いなどが挙げられる。

^{生成されたピッキングリストは、いくつかのソフトウェアパッケージ[9]}からエクスポートすることができ、タンパク質スポットのゲル内自動消化と、それに続く質量分析によるタンパク質の同定に使用することができます。質量分析は、1000～4000原子質量単位の範囲のペプチドの配列決定とともに、正確な質量測定値を特定することができます。 ^[10] 2DEゲル画像のソフトウェア分析の現在のアプローチの概要については、Berth et al. ^[11]またはBandow et al. ^{[12]を参照してください。}

参照

参考文献

^ O'Farrell, PH (1975). 「タンパク質の高解像度2次元電気泳動」J. Biol. Chem . 250 (10): 4007–21 . doi : 10.1016 /S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754. PMID 236308.
^ Klose, J (1975). 「マウス組織の等電点電気泳動と組み合わせたタンパク質マッピング。哺乳類における誘発性点突然変異の検査に対する新しいアプローチ」。Humangogenetik。26 ( 3 ): 231– 43。doi : 10.1007/bf00281458。PMID 1093965。S2CID 30981877。
^ Switzer RC 3rd、 Merril CR 、 Shifrin S (1979)。「ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質およびペプチドを検出するための高感度銀染色」。分析生化学。98 (1): 231– 37。doi :10.1016/0003-2697(79)90732-2。PMID 94518 。
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^ Arora PS、Yamagiwa H、Srivastava A、Bolander ME、Sarkar G (2005)。「関節疾患患者の滑液を用いた2つの2次元ゲル電気泳動画像解析ソフトウェアアプリケーションの比較評価」。J Orthop Sci . 10 (2): 160– 66. doi :10.1007/s00776-004-0878-0. PMID 15815863. S2CID 45193214.
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^ 欠損値とは何ですか? また、なぜ問題になるのですか?
^ 「2-D ゲル電気泳動プロテオミクス解析ソフトウェア | SameSpots」。TotalLab。2024年 7 月 8 日閲覧。
^ Lepedda、Antonio J、Marilena Formato。「2次元電気泳動技術のアテローム性動脈硬化症研究への応用」EJIFCC vol. 19,3 146–159。2008年12月20日
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外部リンク

2次元ゲル電気泳動に関する図書館リソース

ライブラリ内のリソース
他の図書館のリソース

SameSpots 2-D プロテオミクス解析ソフトウェア。
JVirGel シーケンスデータから仮想 2D ゲルを作成します。
Gel IQ 2D ゲル画像解析データの品質を評価するための、無料でダウンロードできるソフトウェアツールです。
2-D電気泳動の原理と方法ハンドブック

[1] O'Farrell, PH (1975). 「タンパク質の高解像度2次元電気泳動」J. Biol. Chem . 250 (10): 4007–21 . doi : 10.1016 /S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754. PMID 236308.

[2] ^ Klose, J (1975). 「マウス組織の等電点電気泳動と組み合わせたタンパク質マッピング。哺乳類における誘発性点突然変異の検査に対する新しいアプローチ」。Humangogenetik。26 ( 3 ): 231– 43。doi : 10.1007/bf00281458。PMID 1093965。S2CID 30981877。

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[4] スーザン・ミケルセン;コルトン、エドゥアルド (2004)。生物分析化学。ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、p. 224.ISBN 978-0-471-62386-1。

[5] Arora PS、Yamagiwa H、Srivastava A、Bolander ME、Sarkar G (2005)。「関節疾患患者の滑液を用いた2つの2次元ゲル電気泳動画像解析ソフトウェアアプリケーションの比較評価」。J Orthop Sci . 10 (2): 160– 66. doi :10.1007/s00776-004-0878-0. PMID 15815863. S2CID 45193214.

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[7] Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC, et al. (2008年4月). 「ゲルベースプロテオミクスデータの多変量統計解析における欠損値の処理」.プロテオミクス. 8 (7): 1371– 83. doi :10.1002/pmic.200700975. hdl : 1942/8262 . PMID 18383008. S2CID 21152053.

[8] 欠損値とは何ですか? また、なぜ問題になるのですか?

[9] 「2-D ゲル電気泳動プロテオミクス解析ソフトウェア | SameSpots」。TotalLab。2024年 7 月 8 日閲覧。

[10] Lepedda、Antonio J、Marilena Formato。「2次元電気泳動技術のアテローム性動脈硬化症研究への応用」EJIFCC vol. 19,3 146–159。2008年12月20日

[11] Berth M、Moser FM、Kolbe M、Bernhardt J (2007 年 10 月)。「2 次元ゲル電気泳動画像の分析における最新技術」。Appl . Microbiol. Biotechnol . 76 (6): 1223– 43. doi :10.1007/s00253-007-1128-0. PMC 2279157. PMID 17713763 。

[12] Bandow JE、Baker JD、Berth M、他 (2008 年 8 月)。「2-D ゲルの画像解析ワークフローの改善により、大規模な 2-D ゲルベースのプロテオミクス研究が可能に - COPD バイオマーカー発見研究」。プロテオミクス。8 ( 15 ) : 3030– 41。doi :10.1002 / pmic.200701184。PMID 18618493。S2CID 206361897。