イースタンブロット

イースタンブロット、またはイースタンブロッティングは、脂質、リン酸、複合糖質の添加を含むタンパク質の翻訳後修飾を分析するために使用される生化学技術です。これは、炭水化物 エピトープの検出に最もよく使用されます。したがって、イースタンブロットは、ウエスタンブロットの生化学技術の延長と考えることができます。「イースタンブロット」という用語で説明されている技術は複数ありますが、そのほとんどは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE) ゲルからポリフッ化ビニリデンまたはニトロセルロース膜にブロットされたリン酸化タンパク質を使用します。転写されたタンパク質は、脂質、炭水化物、リン酸化、またはその他のタンパク質修飾を検出できるプローブを使用して、翻訳後修飾について分析されます。イースタンブロッティングは、標準的なファーウエスタンブロットと区別して、翻訳後修飾とプローブの特定の相互作用を通じてターゲットを検出する方法を指すために使用されます。原理的には、イースタンブロッティングはレクチンブロッティング（すなわち、タンパク質または脂質上の炭水化物エピトープの検出）に類似している。^[1]

イースタンブロットという用語の定義は、複数の著者が新しい方法をイースタンブロット、またはその派生語と呼んでいるため、やや混乱しています。すべての定義は、1979年にTowbinによって開発されたウエスタンブロットの技術から派生したものです。 ^[2]現在の定義は、名前が最初に使用された順に以下にまとめられていますが、すべて以前の研究に基づいています。場合によっては、この用語が導入される前から、この技術がしばらく実践されていました。

• (1982)イースタンブロッティングという用語は、2つの別々のグループによって明確に否定されました。ラインハートとマラマッドは、ネイティブゲルのタンパク質ブロットをネイティブブロットと呼びました。^{[3]ペフェロエンらは、ドデシル硫酸ナトリウムゲルで分離されたタンパク質を真空を使用してニトロセルロースに引き出す方法を}真空ブロッティングと呼ぶことにしました。[ ^{4] [5]}
• （1984）中東ブロッティングは、ポリA RNA（アガロースで分離）をブロットし、その後固定化する手法として説明されている。固定化されたRNAは、その後DNAを使用してプローブされる。^[6]
• (1996)イースタンウェスタンブロット法は、ボグダノフらによって初めて使用されました。^[7]この方法は、ポリフッ化ビニリデンまたはニトロセルロース膜にリン脂質をブロッティングした後、従来のウェスタンブロッティングによって同じニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、コンフォメーション特異的抗体でプローブします。この方法は、1994年のタキらによる以前の研究に基づいており、彼らはこれを当初TLCブロッティングと名付けました。^[8]また、1984年にトウビンによって導入された同様の方法に基づいています。^[9]
• （2000）ファーイースタンブロッティングは、 2000年に石川と滝によって初めて命名されたようです。^{[10]この方法は}ファーイースタンブロットの記事でより詳細に説明されていますが、ポリフッ化ビニリデン膜に転写された脂質の抗体またはレクチン染色に基づいています。
• (2001)イースタンブロッティングは、 BSA をポリフッ化ビニリデン膜にブロッティングし、過ヨウ素酸処理することによって生成される糖複合体を検出する技術として説明されました。次に、酸化されたタンパク質を複合混合物で処理し、膜上に新しい複合体を生成します。次に、膜を抗体でプローブして、目的のエピトープを探します。^[11]この方法は、同じグループによる後の研究でも議論されています。^{[12] [13]}この方法は、本質的にはファーイースタンブロットです。^[14]
• （2002）イースタンブロットは、 PAGEゲルから逆極性で流したタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜にブロットして行う免疫ブロット法を説明するためにも使われてきました。^{[15]これは本質的には}ウエスタンブロットなので、電荷反転を利用してこの方法をイースタンブロットと名付けました。^{[16] [17]}
• （2005）イースタンブロットは、抗体ではなくアプタマーをプローブとして、ポリフッ化ビニリデン膜上にタンパク質をブロットする方法です。[ 18 ^]これはサザンブロットに似ているように見えますが、相互作用は2つのDNA分子ではなく、DNA分子（アプタマー）とタンパク質の間で起こります。^{[19]この方法は}サウスウェスタンブロットに似ています。
• （2006）イースタンブロッティングは、相補性による融合タンパク質の検出を指すために使用されています。この名前は、検出の一部として酵素活性化因子（EA）を使用することに基づいています。^{[20] [21] [22]}
• （2009）イースタンブロッティングは、最近トーマスらによって、ポリフッ化ビニリデン膜にブロットされたタンパク質をレクチン、コレラ毒素、化学染色剤でプローブし、グリコシル化、リポイル化、またはリン酸化タンパク質を検出する技術として再命名されました。^[14]これらの著者は、レクチンプローブと他の染色試薬を使用する点で、タキらによって命名されたファーイースタンブロット^[10]とこの方法を区別しています。
• （2009）イースタンブロットは、抗体ではなくアプタマーをプローブとしてニトロセルロース膜上にタンパク質をブロットする方法です。[ 23 ^]この方法はサウスウェスタンブロットに似ています。
• （2011）最近の研究では、コンカナバリンAなどのレクチンを用いた糖タンパク質の検出をイースタンブロッティングという用語で表現した^[24]

この用語には、明らかに単一の定義は存在しません。最近の注目記事^{[25]では、}サザンブロットの創始者であるエド・サザン氏にインタビューし、田中ら^{[12]による}イースタンブロットの改名について語っています。記事では、イースタンブロットを「妖精、ユニコーン、無料の昼食」に例え、イースタンブロットは「存在しない」と述べています。イースタンブロットは、一般的なブロット法 (サザン、ノーザン、ウエスタン) を比較した免疫学の教科書で言及されており、「しかし、イースタンブロットは試験問題にしか存在しない」と述べています。^[26]

グリカンを検出するイースタンブロッティングの原理は、タンパク質の糖化を検出するためにレクチンを使用したことに遡ります。この検出法の最も古い例は、1976年のTannerとAnsteeによるもので、レクチンを使用してヒト赤血球から単離された糖化タンパク質を検出しました。^[27]ブロッティングによる糖化の特異的検出は、通常、レクチンブロッティングと呼ばれます。このプロトコルの最近の改良の概要は、H. Freezeによって提供されています。^[1]

この技術の応用例の1つに、 Ehrlichia属細菌の2種、E. murisとIOEにおけるタンパク質修飾の検出があります。コレラ毒素Bサブユニット（ガングリオシドに結合）、コンカナバリンA（マンノース含有グリカンを検出）、およびニトロホスホモリブデン酸メチルグリーン（リン酸化タンパク質を検出）を使用して、タンパク質修飾を検出しました。この技術により、非毒性E.murisの抗原タンパク質は、毒性の強いIOEよりも翻訳後修飾が進んでいることが示されました。^[14]

mRNAから翻訳されるタンパク質のほとんどは、細胞内で機能する前に修飾を受けます。これらの修飾は総称して翻訳後修飾と呼ばれます。生理学的条件下では安定している新生タンパク質または折り畳まれたタンパク質は、その後、側鎖または骨格上で一連の特定の酵素触媒修飾を受けます。

タンパク質の翻訳後修飾には、アセチル化、アシル化（ミリストイル化、パルミトイル化）、アルキル化、アルギニル化、ADP-リボシル化、ビオチン化、ホルミル化、ゲラニルゲラニル化、グルタミル化、グリコシル化、グリシル化、水酸化、イソプレニル化、リポイル化、メチル化、ニトロアルキル化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、セレン化、 S-ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、トランスグルタミネーション、スルフィニル化、スルホニル化およびユビキチン化（SUMO化、NEDD化）が含まれます。^{[28] [29]}

アミノ酸鎖のN 末端で起こる翻訳後修飾は、生体膜を通過する際に重要な役割を果たします。これには、原核生物および真核生物の分泌タンパク質のほか、リソソーム、葉緑体、ミトコンドリア、細胞膜などのさまざまな細胞膜や細胞小器官膜に組み込まれることを意図したタンパク質が含まれます。翻訳後タンパク質の発現は、いくつかの疾患において重要です。

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