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ノースウェスタンブロットはノースウェスタンアッセイとも呼ばれ、ウエスタンブロットとノーザンブロットを組み合わせた分析技術で、分子生物学でRNAとタンパク質の相互作用を検出するために使用されます。関連技術であるウエスタンブロットは、ゲル電気泳動で分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移し、目的のタンパク質を検出するために使用されます。特定の標的タンパク質を含む膜上のバンドに沿って、色のついた沈殿物が集まります。ノーザンブロットは同様の分析技術で、目的のタンパク質を検出するのではなく、同様の膜上でRNA（または単離されたmRNA）を検出することにより遺伝子発現を研究します。ノースウェスタンブロットは2つの技術を組み合わせたもので、特に、同様のニトロセルロース膜上に固定化されたタンパク質と相互作用する標識RNAを識別します。
歴史
エドウィン・サザンは、DNAを検出するために使用される分析技術であるサザンブロット[ 1]を最初に考案しました。この技術には、ゲル電気泳動を使用する重要な分析方法が含まれます。この方法では、電界を使用し、荷電したDNA、RNA、またはタンパク質をその電界を介してサイズと電荷に基づいて移動させます。[2] サザンブロットでは、分離されたDNA断片は検出のためにフィルター膜に転送されます。[1] 検出は、膜上でバンドが見え、特定の分子と相関するようになったときに行われます。[2] その後、さまざまな分子または分子間の相互作用を検出するために、同様の命名法で他の同様のブロッティング技術が作成されました。これらの技術には、ウエスタンブロット（タンパク質検出）、ノーザンブロット（RNA検出）、サウスウエスタンブロット（DNA-タンパク質相互作用検出）、イースタンブロット（翻訳後修飾検出）、ノースウエスタンブロット（RNA-タンパク質相互作用検出）が含まれます。[3] [4] [5] [6]
テクニックの詳細
ノースウェスタンブロット法では、RNA結合タンパク質をゲル電気泳動で分離します。この方法では、RNA結合タンパク質をサイズと電荷に基づいて分離します。個々のサンプルをアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル（通常はSDS-PAGE）にロードして、複数のサンプルを同時に分析することができます。[5]ゲル電気泳動が完了すると、ゲルと関連するRNA結合タンパク質はニトロセルロース転写紙に転写されます。[7]
新しく転写されたブロットは、ブロッキング溶液に浸されます。脱脂乳とウシ血清アルブミンが一般的なブロッキング緩衝液です。[8] このブロッキング溶液は、一次抗体および/または二次抗体がニトロセルロース膜に非特異的に結合するのを防ぐのに役立ちます。ブロッキング溶液がブロットと十分に接触したら、特異的な競合RNAを適用し、室温でインキュベートします。この間、競合RNAはブロット上のサンプル内のRNA結合タンパク質に結合します。このプロセス中のインキュベーション時間は、適用した競合RNAの濃度に応じて異なりますが、通常は1時間です。[9] インキュベーションが完了したら、ブロットは通常、溶液中のRNAを希釈するために、1回の洗浄につき5分間、少なくとも3回洗浄されます。一般的な洗浄緩衝液には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または10％Tween 20溶液があります。[10] 不適切または不十分な洗浄はブロットの現像の鮮明度に影響します。洗浄が完了したら、ブロットは通常、X線または同様のオートラジオグラフィー法で現像されます。[11]
アプリケーション
X 線またはオートラジオグラフィーを使用してブロットを現像した後、結果を分析して解釈し、目的の RNA 結合タンパク質のおおよそのサイズと濃度を決定して、タンパク質をさらに研究することができます。ブロット上の RNA 結合タンパク質の位置と濃度は結果に影響を与える可能性があり、現像後にバンドが現れることもあります。これらのバンドは、研究者が目的の RNA 結合タンパク質のサイズと濃度を決定するのに役立ちます。[12] タンパク質のおおよそのサイズがわかっている場合は、元のサンプルをクロマトグラフィー装置で処理してサイズ別に分離することができます。[13] さらに、タンパク質が単離されたら、トリプシンで消化し、質量分析法を使用してペプチドを配列決定し、特定のタンパク質の正体を決定することができます。[14]
利点と欠点
ノースウェスタンブロッティングの利点には、RNAに結合する特定のタンパク質の迅速な検出と、それらのタンパク質のおおよその分子量の評価が含まれます。[15] ノースウェスタンブロッティングでは、安価な方法で特定されたタンパク質を検出できます。ブロットは通常、おおよその分子量の特定を可能にするため、研究の最初のステップです。分子量がわかれば、クロマトグラフィーなどの他の方法によるさらなる研究や精製が可能になります。ノースウェスタンブロッティングのもう1つの利点は、同族リガンドの発現ライブラリの構築に役立つことです。[16]
注目すべき欠点は、RNA結合特性の弱いRNA-タンパク質相互作用は、この技術では検出できない可能性があることです。[15] また、ブロッティングの手順には3〜5時間かかります。手順が正しく行われないと、バックグラウンドが大きくなり、特定されたタンパク質のブロットが不明瞭になる可能性があります。さらに、タンパク質は分離されてニトロセルロース膜に転写された後、元の状態に戻す必要があります。最後の欠点は、タンパク質が単一のポリペプチドまたはゲルマトリックス内で共移動する2つのサブユニットで構成されなければならないことです。[17]
参照
プロトコル
若いイネ穂からのタンパク質-RNA相互作用のノースウェスタンブロット
RNA分離とノーザンブロット分析
タンパク質ブロッティング
参考文献
- ^ ab サザン、エドウィン・メラー（1975年11月5日）。「ゲル電気泳動で分離されたDNA断片中の特定配列の検出」。分子生物学ジャーナル。98 （ 3）：503–517。doi ： 10.1016 /S0022-2836 （ 75）80083-0。ISSN 0022-2836。PMID 1195397。S2CID 20126741 。
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