ウェスタンブロットの標準化

ウエスタンブロットデータの正規化は、さまざまな実験処理下でのブロットまたはゲルのレーン全体、または組織や発達段階全体にわたって、特定のタンパク質の相対的な存在量を比較するために実行される分析ステップです。[ ^{1] [2]正規化の全体的な目標は、一貫性のないサンプル調製、ゲルレーン全体にわたる不均等なサンプルローディング、または不均一なタンパク質移動など、}ウエスタンブロットデータ から得られる結論を損なう可能性のある実験誤差の変動から生じる影響を最小限に抑えることです。^[1]現在、ウエスタンブロットデータを正規化する方法は、(i) ハウスキーピングタンパク質正規化と (ii) 総タンパク質正規化の 2 つがあります。^{[1] [2] [3] [4]}

正規化はゲルまたはブロッティング膜上で直接行われます。まず、染色されたゲルまたはブロットを画像化し、各レーンの標的タンパク質の周りに四角形を描き、四角形内の信号強度を測定します。^[1]得られた信号強度は、同じゲルまたはブロットで検出されたローディング内部コントロールの信号強度に対して正規化できます。^[1]タンパク質染色を使用する場合、染色の種類に応じて、膜を免疫検出の前または後に選択した染色でインキュベートすることができます。^[5]

β-アクチン、GAPDH、HPRT1、RPLP1などのハウスキーピング遺伝子やタンパク質は、実験間で恒常的に同じレベルで発現していると考えられているため、ウェスタンブロットの内部コントロールとしてよく使用されます。 ^{[1] [2] [6] [7]}しかし、最近の研究では、ハウスキーピングタンパク質（HKP）の発現は、さまざまな細胞タイプや生物学的条件で変化する可能性があることが示されています。^{[1] [8] [9] [10]}そのため、科学出版社や資金提供機関は現在、結果の再現性と正確性を確保するために、各実験で正規化コントロールを事前に検証することを要求しています。^{[8] [9] [10]}

蛍光抗体を使用してウェスタンブロットでタンパク質を画像化する場合、正規化では、ユーザーが定量の上限と下限を定義し、各抗原の信号強度とサンプル質量の線形関係を特徴付ける必要があります。^[1]ターゲットタンパク質と正規化コントロールの両方が、検出のダイナミックレンジ内で蛍光を発する必要があります。^[1]多くの HKP は高レベルで発現しており、高発現のターゲットタンパク質と一緒に使用するのに適しています。^[1]発現の低いタンパク質を同じブロットで検出するのは困難です。^[1]

蛍光抗体は市販されており、結果の一貫性を確保するために完全に特性評価された抗体が推奨される。^{[11] [12] [13]}

蛍光検出を利用しない場合、ローディングコントロールタンパク質と目的タンパク質の分子量は大きく異なる必要があり、正確な分析のためにはゲル電気泳動によって適切に分離される必要がある。^[1]

同じブロット上で複数のタンパク質標的を検出する場合、膜を剥離し、新しい検出抗体セットを使用して再プローブする必要があります。^[6]剥離が効果的でないと、標的タンパク質からの信号が弱くなる可能性があります。^[6]抗原の損失を防ぐために、膜1枚あたり3回の剥離インキュベーションのみが推奨されます。^[6]非常に豊富なタンパク質からの信号を完全に除去することは難しい可能性があるため、最初に発現の低いタンパク質を検出することをお勧めします。^[6]

HKPレベルは組織間で一貫性がない可能性があるため、科学者は抗体の直線範囲内で既知の濃度の純粋な外因性タンパク質をスパイクインすることで、目的のタンパク質をコントロールすることができます。 ^{[8] [9] [10]} HKPと比較して、スパイクインコントロールにはより多様なタンパク質が利用可能です。^[14]

総タンパク質正規化（TPN）では、標的タンパク質の存在量が各レーンのタンパク質総量に対して正規化されます。^{[3] [4]} TPNは単一のローディングコントロールに依存しないため、コントロールの検証やHKP検出のためのブロットのストリッピング/再プロービングは必要ありません。^{[6] [15]}これにより、精度（レーンあたり総タンパク質0.1μgまで）、費用対効果、およびデータの信頼性が向上します。^[16]

蛍光染色および染色フリーゲルでは、ゲル/ブロット上のタンパク質を視覚化するために特別な装置が必要です。^[5]染色はブロットを均一に覆わない可能性があり、ブロットの中央よりも端の方に染色が多く集まる可能性があります。画像が不均一な場合、正規化が不正確になる可能性があります。^[1]

ポンソーSやクマシーブリリアントブルーなどのアニオン性染料や、シプロルビーやディープパープルなどの蛍光染料は、下流の免疫検出に影響を与えないため、抗体を添加する前に使用されます。^{[17] [18] [19] [20]}

ポンソーSは、タンパク質を赤みがかったピンク色に染色する負に帯電した可逆染料で、水で洗うだけで簡単に除去できます。^{[21] [22]}ポンソーS染色の強度は時間の経過とともに急速に低下するため、記録は迅速に行う必要があります。^[5]ポンソーSの直線範囲は最大140μgですが、染色強度が時間に依存し、信号対雑音比が低いため、再現性が低いことが報告されています。^{[21] [22]}

Sypro Rubyのような蛍光染料は、広い直線範囲を持ち、アニオン性染料よりも感度が高い。^[22]これらは永久的で光安定性のある染色であり、標準的なUVまたは青色光透過照明器またはレーザースキャンで視覚化できる。^{[1] [22]膜は、フィルムまたは}電荷結合素子 カメラを使用してデジタルで記録することができる。^[23] Sypro Rubyブロット染色は時間がかかり、レーンあたり50μgを超えるタンパク質で飽和する傾向がある。^[22]

アミドブラックは、一般的に使用されている永久抗体後陰イオン染色で、ポンソーSよりも感度が高い。^[24]この染色は免疫検出後に適用されます。^[24]

染色フリー技術は、ゲル内化学反応を利用してイメージングを行う。^{[22] [25] [26]}この化学反応は、タンパク質の移動や下流の抗体結合に影響を与えない。^[27]また、染色/脱色工程を必要とせず、バンドの強度は時間の経過とともに一定に保たれる。^[28]

染色フリー技術では、トリプトファン残基を含まないタンパク質を検出できません。検出を可能にするには、少なくとも 2 つのトリプトファンが必要です。^[5]染色フリー正規化の線形範囲は、18 ウェルの場合はレーンあたり最大 80 μg のタンパク質、12 ウェルの Criterion 中型ゲルの場合はレーンあたり最大 100 μg です。この範囲は、定量的ウェスタン ブロットの一般的なタンパク質負荷と互換性があり、広いタンパク質負荷範囲にわたる負荷制御計算を可能にします。^{[29] [4]}より効率的な染色フリー法も最近利用可能になりました。^{[30] [31]}高タンパク質負荷を使用する場合、染色フリー技術は染色よりも大きな成果を上げています。^[29]

• ウェスタンブロッティングにおける実用的、便利、かつ信頼性の高い総タンパク質ローディングコントロールのための V3 染色フリーワークフロー