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リボヌクレアーゼH（略称RNase HまたはRNH ）は、 RNA/ DNA基質中のRNAを加水分解機構によって切断する非配列特異的エンドヌクレアーゼ酵素のファミリーです。RNase Hファミリーのメンバーは、細菌から古細菌、真核生物まで、ほぼすべての生物に見られます。
このファミリーは、基質特異性がわずかに異なる進化的に関連のあるグループに分けられ、リボヌクレアーゼH1とH2と大まかに呼ばれています。[ 2 ]ヒトゲノムはH1とH2の両方をコードしています。ヒトのリボヌクレアーゼH2は3つのサブユニットからなるヘテロ三量体複合体であり、いずれかのサブユニットの変異は、アイカルディ・グティエール症候群として知られる希少疾患の遺伝的原因の一つです。[ 3 ] H2に密接に関連する第3のタイプは、少数の原核生物にのみ見られますが、[ 4 ] H1とH2は生命のすべてのドメインに存在します。[ 4 ]さらに、RNase H1様レトロウイルスリボヌクレアーゼHドメインは、 HIVなどのレトロウイルスによってコードされ、ウイルス複製に必要とされるマルチドメイン逆転写酵素タンパク質に存在します。[ 5 ] [ 6 ]
真核生物では、リボヌクレアーゼH1はミトコンドリアゲノムのDNA複製に関与している。H1とH2は両方とも、Rループ構造の処理などのゲノム維持タスクに関与している。[ 2 ] [ 7 ]
リボヌクレアーゼHは、 RNA - DNA二重らせんのRNA鎖に対する共通の基質特異性を持つエンドヌクレアーゼ酵素のファミリーです。定義上、RNase HはRNA骨格のホスホジエステル結合を切断し、 3'ヒドロキシル基と5'リン酸基を残します。[ 7 ] RNase Hは、レトロウイルスインテグラーゼ、DNAトランスポザーゼ、ホリデージャンクションリゾルバーゼ、PiwiおよびArgonauteタンパク質、さまざまなエキソヌクレアーゼ、およびスプライソソームタンパク質Prp8などの他のヌクレアーゼおよび核酸処理酵素を含む進化的に関連するスーパーファミリーのメンバーとして提案されています。[ 8 ] [ 9 ]
RNase H は大きく H1 と H2 の 2 つのサブタイプに分けられ、歴史的な理由から真核生物ではアラビア数字、原核生物ではローマ数字で命名されています。したがって、大腸菌のRNase HI はヒトのRNase H1の相同体です。[ 2 ] [ 7 ]大腸菌や他の多くの原核生物では、rnhA遺伝子が HI を、rnhB遺伝子が HII をコードしています。関連する 3 番目のクラスである HIII は、少数の細菌と古細菌に存在し、原核生物の HII 酵素と密接に関連しています。[ 4 ]
RNase H の構造は、一般的に 5 本のβ シートがα ヘリックスの分布に囲まれた構造です。[ 10 ]すべての RNase H は、アスパラギン酸とグルタミン酸残基からなる保存された配列モチーフを中心とした活性部位を持ち、これはしばしば DEDD モチーフと呼ばれます。これらの残基は、触媒に必要なマグネシウムイオンと相互作用します。 [ 7 ] [ 5 ]
RNase H2 は H1 よりも大きく、通常は追加のヘリックスを持っています。酵素のドメイン構成は様々です。原核生物の H1 グループのメンバーの一部と真核生物のほとんどのメンバーは、 N 末端に「ハイブリッド結合ドメイン」と呼ばれる追加の小さなドメインを持ち、RNA:DNA ハイブリッド二重らせんへの結合を促進し、プロセス性を高めることがあります。[ 2 ] [ 7 ] [ 11 ] H1 グループのすべてのメンバーと H2 グループの原核生物メンバーはモノマーとして機能しますが、真核生物の H2 酵素は必須のヘテロ三量体です。[ 2 ] [ 7 ]原核生物の HIII 酵素は、より広範な H2 グループのメンバーであり、N 末端のTATA ボックス結合ドメインが追加されている点を除いて、H2 とほとんどの構造的特徴を共有しています。[ 7 ]多ドメイン逆転写酵素タンパク質に存在するレトロウイルス RNase H ドメインは、H1 グループによく似た構造を持っています。[ 5 ]
RNase H1 は、構造と酵素活性の関係を探るために広く研究されてきました。また、特に大腸菌ホモログは、タンパク質フォールディングを研究するためのモデルシステムとしても使用されています。[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] H1 グループ内では、より高い基質結合親和性と、より大きくより塩基性の高い基質結合面を提供するヘリックスと柔軟なループからなる構造要素の存在との間に相関関係が確認されています。C ヘリックスは分類学的に散在しており、大腸菌およびヒト RNase H1 ホモログに存在し、HIV RNase H ドメインには存在しませんが、C ヘリックスを持つレトロウイルス ドメインの例は存在します。[ 15 ] [ 16 ]
リボヌクレアーゼH酵素は、二本鎖RNA:DNAハイブリッド中のRNAのホスホジエステル結合を切断し、切断部位の両端に3'ヒドロキシル基と5'リン酸基を残します。この切断は、Mg2 +やMn2 +などの2つの二価カチオンが触媒機能に直接関与する2つの金属イオン触媒機構によって行われます。[ 17 ]これらのRNase Hは、アミノ酸配列の違いに応じて、タイプ1とタイプ2のRNase Hに分類されます。[ 7 ] [ 18 ]タイプ1のRNase Hには、原核生物および真核生物のRNase H1とレトロウイルスRNase Hがあります。タイプ2のRNase Hには、原核生物および真核生物のRNase H2と細菌RNase H3があります。これらのRNase Hは、真核生物のRNase H2を除いて単量体として存在し、真核生物のRNase H2はヘテロ三量体として存在します。[ 19 ] [ 20 ] RNase H1とH2は、基質特異性と細胞内での機能が異なるが重複しています。原核生物と下等真核生物ではどちらの酵素も必須ではありませんが、高等真核生物では両方とも必須であると考えられています。[ 2 ] H1とH2酵素の両方の複合活性は、RループのRNA成分の分解によるゲノム安定性の維持に関連しています。[ 21 ] [ 22 ]
リボヌクレアーゼH1酵素は基質中に少なくとも4つのリボヌクレオチドを含む塩基対を必要とし、それ以外の部分がデオキシリボヌクレオチドで構成されている鎖から単一のリボヌクレオチドを除去することはできません。このため、RNase H1酵素がDNA複製中の岡崎フラグメントからのRNAプライマーの処理に関与している可能性は低いと考えられています。[ 2 ] RNase H1は、研究されている単細胞生物では必須ではありません。大腸菌では、RNase H1ノックアウトは温度感受性表現型をもたらし、[ 7 ] S. cerevisiaeでは、ストレス応答の欠陥を引き起こします。[ 23 ]
哺乳類を含む多くの真核生物では、RNase H1 遺伝子にはミトコンドリア標的配列が含まれており、 MTS が存在する場合と存在しない場合の両方のアイソフォームが発現します。その結果、RNase H1 はミトコンドリアと核の両方に局在します。ノックアウトマウスモデルでは、RNase H1 欠損変異体は、ミトコンドリア DNA の複製に欠陥があるため、胚発生中に致死となります。[ 2 ] [ 24 ] [ 25 ] RNase H1 の喪失によって誘発されるミトコンドリア DNA 複製の欠陥は、R ループ処理の欠陥によるものと考えられます。[ 22 ]
原核生物では、RNase H2 は単量体タンパク質として酵素活性を持つ。真核生物では、触媒サブユニット A と構造サブユニット B および C からなる必須ヘテロ三量体である。A サブユニットは原核生物の RNase H2 と非常に相同性が高いが、B および C サブユニットは原核生物には明らかな相同性がなく、真核生物間でも配列レベルでの保存性が低い。[ 26 ] [ 27 ] B サブユニットは、H2 複合体とPCNAとの間のタンパク質間相互作用を媒介し、H2 を複製焦点に局在させる。[ 28 ]
原核生物と真核生物のH2酵素はどちらも鎖中の単一のリボヌクレオチドを切断できます。[ 2 ]ただし、切断パターンと基質特異性はわずかに異なります。原核生物の酵素はプロセス性が低く、 5'デオキシリボヌクレオチドを持つリボヌクレオチドよりも連続するリボヌクレオチドをより効率的に加水分解しますが、真核生物の酵素はプロセス性が高く、両方のタイプの基質を同様の効率で加水分解します。[ 2 ] [ 27 ] RNase H2の基質特異性により、 Rループ処理に加えて、誤って取り込まれたリボヌクレオチドをDNAから除去するリボヌクレオチド除去修復の役割を担っています。[ 29 ] [ 30 ] [ 28 ] H1とH2の両方が哺乳類細胞の核に存在しますが、H2がそこでRNase H活性の主要な供給源であり、ゲノムの安定性を維持するために重要です。[ 28 ]
原核生物の中には、原核生物の遺伝子に使用されるローマ数字命名法でRNase HIIIと命名された追加のH2型遺伝子を持つものがある。HIIIタンパク質は、配列同一性および構造類似性においてH2グループにより近い関係にあるが、基質特異性はH1により近い。[ 7 ] [ 31 ] HIとHIIはどちらも原核生物に広く分布しているのに対し、HIIIは分類学的に散在する少数の生物にしか見られない。古細菌ではやや一般的で、HIと同じ原核生物ゲノムにはめったに、あるいは全く見られない。[ 32 ]
ほぼすべてのRNase Hの活性部位には、DEDDモチーフとして知られる4つの負電荷を持つアミノ酸残基が含まれています。多くの場合、ヒスチジンも存在します（例：HIV-1、ヒト、または大腸菌）。[ 2 ] [ 7 ]
荷電残基は触媒作用に必要な2つの金属イオンと結合します。生理的条件下ではこれらはマグネシウムイオンですが、マンガンも通常は酵素活性をサポートします[ 2 ] [ 7 ] 。一方、カルシウムまたは高濃度のMg2 +は活性を阻害します[ 11 ] [ 33 ] [ 34 ] 。
実験的証拠とコンピューターシミュレーションに基づくと、この酵素は保存されたヒスチジンを持つ金属イオンの1つに結合した水分子を活性化します。[ 33 ] [ 35 ]遷移状態は会合性であり[ 17 ]、プロトン化されたリン酸と脱プロトン化されたアルコキシド脱離基を持つ中間体を形成します。[ 35 ]脱離基は、pKaが高くプロトン化されやすいグルタミン酸を介してプロトン化されます。このメカニズムは、ヒスチジンと2つの金属イオンのメカニズムを使用するRNase TとCas9酵素のRuvCサブユニットに似ています。
切断された生成物の放出のメカニズムはまだ解明されていない。時間分解結晶学や類似のヌクレアーゼからの実験的証拠は、活性部位に動員される反応における第3のイオンの役割を示唆している。 [ 36 ] [ 37 ]
ヒトゲノムには、 RNase Hをコードする遺伝子が4つ含まれている。
さらに、レトロウイルス由来の遺伝物質がゲノム中に頻繁に出現し、ヒト内在性レトロウイルスのゲノムの統合を反映している。このような統合イベントにより、RNase H ドメインを含むレトロウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子が存在する。ERVK6はその例である。[ 38 ]ロングターミナルリピート(LTR) および非ロングターミナルリピート (非 LTR)レトロトランスポゾンもゲノム中に多く存在し、複雑な進化の歴史を持つ独自の RNase H ドメインを含むことが多い。[ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]
小規模な研究では、ヒトRNase H1の変異は、ミトコンドリア病の一般的な特徴である慢性進行性外眼筋麻痺と関連付けられています。[ 25 ]
3 つの RNase H2 サブユニットのいずれかの変異は、アイカルディ・グティエール症候群(AGS)として知られるまれな遺伝性疾患の原因として確立されており、 [ 3 ]若年期に神経学的および皮膚学的症状として現れます。 [ 43 ] AGS の症状は先天性ウイルス感染症の症状とよく似ており、I 型インターフェロンの不適切な上方制御と関連しています。AGS は、核酸処理に関与するTREX1、SAMHD1、ADAR、およびMDA5 /IFIH1 などの他の遺伝子の変異によっても引き起こされる可能性があります。[ 44 ] AGS 患者集団における変異分布の特徴付けでは、すべての AGS 変異の 5% が RNASEH2A、36% が 2B、12% が 2C にあることがわかりました。[ 45 ] 2Bの変異は、やや軽度の神経障害[ 46 ]および他のAGS関連遺伝子型を持つ患者で検出されるインターフェロン誘導遺伝子アップレギュレーションの欠如と関連付けられています。 [ 44 ]
2つのウイルス群は、ライフサイクルの一部として逆転写を利用します。1つは、ゲノムを一本鎖RNAにコードし、二本鎖DNA中間体を介して複製するレトロウイルス、もう1つは、RNA「プレゲノム」中間体を介して二本鎖DNAゲノムを複製するdsDNA-RTウイルスです。病原性の例としては、それぞれヒト免疫不全ウイルスとB型肝炎ウイルスが挙げられます。どちらも、RNase Hドメインを含む大型の多機能逆転写酵素（RT）タンパク質をコードしています。[ 48 ] [ 49 ]
HIV-1およびマウス白血病ウイルス由来のレトロウイルスRTタンパク質は、このファミリーの中で最もよく研究されているメンバーである。[ 50 ] [ 51 ]レトロウイルスRTは、ウイルスの一本鎖RNAゲノムを二本鎖DNAに変換する役割を担っている。このプロセスには3つのステップが必要である。まず、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性により、プラス鎖RNAテンプレートからマイナス鎖DNAが生成され、RNA:DNAハイブリッド中間体が形成される。次に、RNA鎖が破壊される。最後に、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性によりプラス鎖DNAが合成され、最終産物として二本鎖DNAが生成される。このプロセスの2番目のステップは、RTタンパク質のC末端に位置するRNase Hドメインによって実行される。 [ 5 ] [ 6 ] [ 52 ] [ 53 ]
RNase H は、プラス鎖 RNA ゲノムの非特異的分解、マイナス鎖tRNAプライマーの特異的除去、およびプラス鎖プリンリッチポリプリントラクト (PPT) プライマーの除去という 3 種類の切断作用を実行します。 [ 54 ] RNase H はプラス鎖のプライミングに関与しますが、新しいプライマー配列を合成する従来の方法では関与しません。むしろ RNase H は、RNase H による切断に耐性のある PPT からの「プライマー」を作成します。PPT 以外のすべての塩基を除去することで、PPT はロングターミナルリピートの U3 領域の末端のマーカーとして使用されます。[ 53 ]
RNase H活性はウイルスの増殖に必要であるため、このドメインはHIV/AIDSやレトロウイルスによって引き起こされるその他の疾患の治療に使用される抗レトロウイルス薬の開発における薬剤標的と考えられてきた。いくつかの異なる化学型のレトロウイルスRNase H阻害剤が同定されており、その多くは活性部位カチオンのキレート化に基づく作用機序を持つ。 [ 55 ] RTのポリメラーゼ機能を特異的に阻害する逆転写酵素阻害剤は広く臨床で使用されているが、RNase H機能の阻害剤は使用されていない。これは、臨床で使用されている薬剤によってまだ標的とされていないHIVによってコードされる唯一の酵素機能である。[ 52 ] [ 56 ]
RNase H は広く分布しており、生命のすべてのドメインに存在します。このファミリーはヌクレアーゼ酵素のより大きなスーパーファミリーに属しており[ 8 ] [ 9 ]、進化的に古いと考えられています[ 57 ] 。原核生物のゲノムには複数の RNase H 遺伝子が存在することが多いですが、HI、HII、HIII 遺伝子の出現と全体的な系統関係の間にはほとんど相関がなく、水平遺伝子伝達がこれらの酵素の分布を確立する上で役割を果たした可能性があることを示唆しています。RNase HI と HIII が同じ原核生物のゲノムに現れることはまれであり、まったくありません。生物のゲノムに複数の RNase H 遺伝子が含まれている場合、それらの活性レベルに大きな違いがあることがあります。これらの観察は、RNase H 遺伝子間の機能的冗長性を最小限に抑える進化パターンを反映していると考えられています。[ 7 ] [ 32 ]原核生物に特有のRNase HIIIは、分類学的に散在しており、細菌と古細菌の両方に見られます。[ 32 ] HIIからかなり早い時期に分岐したと考えられています。[ 58 ]
真核生物におけるRNase H2の進化の軌跡、特に真核生物の相同体が必須ヘテロ三量体になったメカニズムは不明である。BサブユニットとCサブユニットは原核生物には明らかな相同体を持たない。[ 2 ] [ 27 ]
RNase H は二本鎖 RNA:DNA ハイブリッド中の RNA のみを特異的に分解するため、分子生物学の実験試薬としてよく使用されます。大腸菌RNase HI および HIIの精製標品は市販されています。RNase HI は、逆転写による第一鎖相補的 DNA (cDNA) 合成後に RNA テンプレートを破壊するためによく使用されます。また、短い相補的 DNA セグメントが存在する場合に特定の RNA 配列を切断するためにも使用できます。[ 59 ]表面プラズモン共鳴などの高感度技術を使用して検出できます。[ 60 ] [ 61 ] RNase HII は、岡崎フラグメントの RNA プライマー成分を分解したり、リボヌクレオチドを含む位置に一本鎖ニックを導入したりするために使用できます。 [ 59 ]ホットスタートPCRの変種であるRNase H依存性PCRまたはrhPCRは、超好熱性古細菌Pyrococcus abyssi由来の耐熱性RNase HIIを使用して記述されている。[ 62 ]注目すべきは、試薬として一般的に使用されるリボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、HIまたはHIIの活性を阻害するのに効果的ではないということである。[ 59 ]
リボヌクレアーゼHは、1969年にピーター・ハウゼンの研究室で、研究者らが子牛の胸腺でRNA:DNAハイブリッドエンドヌクレアーゼ活性を発見し、そのハイブリッド特異性を示すために「リボヌクレアーゼH 」と名付けたことで初めて発見されました。[ 26 ] [ 63 ] [ 64 ]その後、RNase H活性は、大腸菌[ 65 ]や、ウイルス逆転写の初期研究中にRNAゲノムを持つ腫瘍ウイルスのサンプルで発見されました。[ 66 ] [ 67 ]後に、子牛の胸腺抽出物にはRNase H活性を持つタンパク質が複数含まれていること[ 68 ]、大腸菌には2つのRNase H遺伝子が含まれていることが明らかになりました。[ 69 ] [ 70 ]元々、真核生物で現在RNase H2として知られる酵素はH1と命名され、その逆も同様でしたが、比較分析を容易にするために真核生物の酵素の名前がE. coliのものと一致するように変更され、原核生物の酵素はローマ数字で、真核生物の酵素はアラビア数字で命名される現代の命名法が生まれました。[ 2 ] [ 26 ] [ 31 ] [ 71 ] 1999年に報告された原核生物RNase HIIIは、最後に同定されたRNase Hサブタイプです。[ 31 ]
真核生物RNase H2の特性解析は、その存在量が少ないこともあり、これまで困難であった。[ 2 ]酵素の精製に慎重に取り組んだ結果、大腸菌RNase H2とは異なり、真核生物酵素は複数のサブユニットを持つことが示唆された。[ 72 ]大腸菌タンパク質（すなわちH2Aサブユニット）のS. cerevisiaeホモログは、酵母ゲノムの配列決定時にバイオインフォマティクスによって容易に同定できたが、[ 73 ]対応するタンパク質は単独では酵素活性を持たないことがわかった。[ 2 ] [ 23 ]最終的に、酵母BおよびCサブユニットは共精製によって単離され、酵素活性に必要であることがわかった。[ 74 ]しかし、酵母のBサブユニットとCサブユニットは、他の生物の相同体との配列相同性が非常に低く、対応するヒトタンパク質は、3つすべての変異がアイカルディ・グティエール症候群を引き起こすことが判明した後に初めて確定的に同定された。[ 2 ] [ 3 ]
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