液体クロマトグラフィー質量分析法

ムービングベルトインターフェース（MBI）は、1977 年に McFadden らによって開発され、Finnigan によって商品化されました。^{[ 15 ]}このインターフェースは、LC カラムの溶出液が帯状に堆積されるエンドレスムービングベルトで構成されていました。ベルト上では、2 つの真空チャンバーで溶媒蒸気を減圧して穏やかに加熱し、効率的に排気することで溶媒が蒸発しました。液相が除去された後、ベルトはヒーターを通過し、分析対象物が MS イオン源にフラッシュ脱着されました。MBI の重要な利点の 1 つは、幅広いクロマトグラフィー条件との互換性でした。^{[ 9 ]} MBI は、EI、CI、および高速原子衝撃(FAB) イオン源を使用して LC と MS 装置を結合できるため、1978 年から 1990 年の間に LC-MS アプリケーションで成功裏に使用されました。MBI インターフェースで LC カラムに接続された最も一般的な MS システムは、磁場セクターおよび四重極装置でした。 LC-MS用のMBIインターフェースにより、MSは医薬品、農薬、ステロイド、アルカロイド、多環芳香族炭化水素の分析に広く応用されるようになった。しかし、このインターフェースは機械的な複雑さ、ベルト交換（または洗浄）の難しさ、そして非常に不安定な生体分子を扱えないことから、現在では使用されなくなっている。

直接液体導入（DLI）インターフェースは1980年に開発されました。このインターフェースは、キャピラリー入口インターフェース内部での液体の蒸発の問題を解決することを目的としていました。DLIでは、LCフローのごく一部が小さな開口部または隔膜（通常 直径10μm）を通過して、小さな液滴からなる液体ジェットを形成し、その後、脱溶媒チャンバーで乾燥させます。^{[ 12 ]}分析対象物は、LC溶媒が試薬ガスとして機能する溶媒補助化学イオン化源を使用してイオン化されます。このインターフェースを使用するには、LCカラムから出てくるフローを分割する必要がありました。これは、MSシステムの真空圧力を高くしすぎることなく、流出液のごく一部（1ml/分のうち10～50μl/分）しかイオン源に導入できなかったためです。あるいは、コーネル大学のヘニオンは、マイクロボアLC法を用いることでLCの（低）流量全体を利用できることに成功した。DLIインターフェースの主な運用上の問題の一つは、ダイヤフラムオリフィスの頻繁な目詰まりであった。DLIインターフェースは、1982年から1985年にかけて、農薬、コルチコステロイド、馬尿中の代謝物、エリスロマイシン、ビタミンB12の分析に使用された_{。しかし、このインターフェースは}サーモスプレーインターフェースに置き換えられ、流量制限とダイヤフラムの目詰まりの問題が解消された。^{[ 5 ] [ 9 ]}

関連する装置として、1984 年に Willoughby と Browner によって開発された粒子ビームインターフェース(PBI) がある。 ^{[ 16 ]} 粒子ビームインターフェースは、1988 年に LC-MS の MBI の幅広い用途を引き継いだ。^{[ 9 ] [ 17 ]} PBI は、ヘリウムガスネブライザーを使用して溶出液を真空中に噴霧し、液滴を乾燥させ、溶媒蒸気を排気 (ジェットセパレータを使用) しながら、分析対象物を含む単分散乾燥粒子の流れをイオン源に導入することで動作する。^{[ 12 ]} 液滴をイオン源体積の外で乾燥させ、ジェットセパレータを使用して溶媒蒸気を排気することで、粒子が低圧 EI イオン源に入り、そこで気化される。MBI と同様に、ライブラリ検索可能な EI スペクトルを生成できることは、多くの用途で明確な利点であった。ヒューレット・パッカード社、そして後にVG社とエクストレル社によって商品化されたこの技術は、そこそこの成功を収めたものの、より幅広い化合物の塗布範囲と用途を提供するエレクトロスプレーやAPCIなどの大気圧インターフェースにほぼ取って代わられた。

サーモスプレー（TSP）インターフェースは、1980 年にヒューストン大学のマービン・ベスタルとその同僚によって開発されました。^{[ 18 ]}これは、Vestec 社といくつかの主要な質量分析計メーカーによって商品化されました。このインターフェースは、高流量（1 ml/分）に対応し、DLI インターフェースでの流量分割を回避できる LC-MS インターフェースを見つけることを目的とした長期研究プロジェクトの成果です。TSP インターフェースは、加熱プローブ、脱溶媒チャンバー、およびイオン集束スキマーで構成されていました。LC 流出液は加熱プローブを通過し、蒸気と小さな液滴のジェットとして低圧で脱溶媒チャンバーに流れ込みました。当初は、イオン源としてフィラメントまたは放電を使用して動作していました（これにより、気化した分析対象物の CI 源として機能しました）が、フィラメントまたは放電がオフのときにイオンも観測されることがすぐに発見されました。これは、エレクトロスプレーイオン化またはイオン蒸発に関連するプロセスで液滴が蒸発する際に、液滴からイオンが直接放出されること、または緩衝イオン（酢酸アンモニウムなど）から気化した分析対象分子が化学的にイオン化されることのいずれかに起因する可能性があります。より大きな分析対象物から多価イオンが観察されたという事実は、少なくともいくつかの条件下で分析対象イオンの直接放出が起こっていることを示唆しています。^{[ 12 ]}このインターフェースは、LC カラムから最大 2 ml/min の溶出液を処理することができ、それを MS 真空システムに効率的に導入します。TSP は、逆相液体クロマトグラフィー(RT-LC) を含む LC-MS アプリケーションにもより適していました。時間の経過とともに、TSP の機械的な複雑さは簡素化され、このインターフェースは、医薬品、代謝物、抱合体、ヌクレオシド、ペプチド、天然物、および農薬の分析を含む医薬品アプリケーション向けの最初の理想的な LC-MS インターフェースとして人気になりました。 TSPの導入はLC-MSシステムの大きな進歩であり、1990年代初頭に大気圧イオン化（API）を用いたインターフェースに取って代わられるまで、最も広く用いられたインターフェースであった。^{[ 5 ] [ 8 ] [ 17 ]}

最初の高速原子衝撃（FAB）インターフェースと連続フローFAB（CF-FAB）インターフェースは、それぞれ1985年と1986年に開発されました。^{[ 17 ]}両方のインターフェースは似ていますが、最初のインターフェースは接続チャネルとして多孔質フリットプローブを使用するのに対し、CF-FABはプローブチップを使用する点で異なります。これらのうち、CF-FABはLC-MSインターフェースとしてより成功し、非揮発性および熱不安定性化合物の分析に役立ちました。これらのインターフェースでは、LC流出液はフリットまたはCF-FABチャネルを通過して、チップで均一な液膜を形成します。そこで、液体はイオンビームまたは高エネルギー原子（高速原子）で衝撃されます。安定した動作のために、FABベースのインターフェースは1～15μlの液体流量しか処理できず、マイクロボアおよびキャピラリーカラムにも制限されていました。 FAB MSイオン化源で使用するためには、目的の分析対象物を、LCカラムでの分離の前または後に添加できるマトリックス（例えばグリセロール）と混合する必要がありました。FABベースのインターフェースはペプチドの特性評価に広く使用されていましたが、1988年にエレクトロスプレーベースのインターフェースが登場すると適用性を失いました。 ^{[ 5 ] [ 9 ]}

LC-MS システム用の ESI インターフェースは、1988 年にFennと共同研究者によって開発されました。 ^{[ 26 ]}このイオン源/インターフェースは、中程度の極性を持つ分子や非常に極性を持つ分子 (代謝物、異物、ペプチド、ヌクレオチド、多糖類など) の分析に使用できます。LC カラムから出てくる液体溶出液は、3～5 kV に保たれた金属キャピラリーに導かれ、キャピラリーの先端で高速の同軸ガス流によって噴霧され、真空チャンバーの入口の前に帯電した液滴の微細な噴霧が生成されます。真空システムが緩衝液や塩類によって汚染されるのを避けるため、このキャピラリーは通常、MS システムの入口に垂直に配置され、場合によっては入口の前に乾燥窒素の逆流があり、イオンは電場によってこの窒素を通って誘導されます。一部のソースでは、真空入口の手前でスプレープルームに高温ガスを追加で混合することにより、液滴の急速な蒸発、ひいてはイオン放出の最大化を実現しています。他のソースでは、液滴が真空に入るときに加熱された毛細管を通って引き込まれ、液滴の蒸発とイオン放出が促進されます。これらの液滴蒸発を増加させる方法により、効率的なイオン化^{[ 27 ]}と高い感度を維持しながら、1～2 mL/minの液体流量を使用できるようになりました。その結果、 従来は最適な動作のために1～3 mmのマイクロボアカラムと50～200 μl/minの低い流量の使用が一般的に必要とされていましたが、この制限はもはやそれほど重要ではなくなり、より大きなボアのカラムの高いカラム容量をESI LC-MSシステムで有利に利用できるようになりました。極性を切り替えることで正電荷イオンと負電荷イオンを生成でき、同じLCラン内で交互に正モードと負モードのスペクトルを迅速に取得できます。ほとんどの大きな分子（分子量1500～2000以上）はESIイオン源で多価イオンを生成するが、小さな分子の大部分は一価イオンを生成する。^{[ 8 ]}

LC-MS 用の APCI インターフェースの開発は、1973 年初頭に Horning と共同研究者によって開始されました。^{[ 28 ]}しかし、その商用アプリケーションは、1986 年に Henion と共同研究者が LC-APCI-MS インターフェースを改良した後、1990 年代初頭に導入されました。^{[ 9 ]} APCI イオン源/インターフェースは、小さく、中性で、比較的非極性で、熱的に安定な分子 (ステロイド、脂質、脂溶性ビタミンなど) の分析に使用できます。これらの化合物は、ESI を使用しては十分にイオン化されません。さらに、APCI は緩衝剤を含む移動相ストリームも処理できます。LC システムからの液体はキャピラリーを通してポンプで送られ、先端でネブライザーも行われ、そこでコロナ放電が発生します。まず、インターフェースと移動相溶媒を囲むイオン化ガスがイオン源で化学イオン化されます。その後、これらのイオンは分析対象物と反応して電荷を移動します。サンプルイオンは、イオン集束レンズによって小さなオリフィススキマーを通過します。高真空領域に入ると、イオンは質量分析を受けます。このインターフェースは正電荷モードと負電荷モードで動作させることができ、主に単電荷イオンが生成されます。^{[ 8 ]} APCIイオン源は、500～2000 μl/minの流量にも対応でき、従来の4.6 mm IDカラムに直接接続できます 。^{[ 17 ]}

LC-MS 用の APPI インターフェースは、2000 年に Bruins と Syage によって同時に開発されました。^{[ 29 ] [ 9 ]} APPI は、ESI を使用してイオン化できない中性化合物の分析のための別の LC-MS イオン源/インターフェースです。^{[ 8 ]}このインターフェースは APCI イオン源に似ていますが、コロナ放電の代わりに、放電ランプからの光子を使用してイオン化が行われます。直接 APPI モードでは、光子の吸収と電子の放出によって、一価のアナライト分子イオンが形成されます。ドーパント APPI モードでは、容易にイオン化される化合物 (ドーパント) が移動相またはネブライザーガスに添加され、ドーパント分子イオンとアナライト間の電荷交換反応を促進します。イオン化されたサンプルは、小さなオリフィススキマーを通過する際に、高真空で質量分析器に送られます。^{[ 9 ]}

LC-MSはバイオ分析の分野で広く使用されており、特に医薬品の薬物動態研究に関わっています。薬物動態研究は、薬物が体内の臓器や肝臓の血流からどのくらいの速さで除去されるかを決定するために必要です。MS分析装置は、HPLCシステムに一般的に付属するUV検出器と比較して、分析時間が短く、感度と特異性が高いため、これらの研究に有用です。大きな利点の1つはタンデムMS-MSの使用であり、検出器はフラグメント化する特定のイオンを選択するようにプログラムできます。測定量は、オペレーターによって選択された分子フラグメントの合計です。LC -MSで干渉やイオン抑制がない限り、LC分離は非常に迅速に行うことができます。^{[ 31 ]}

LC-MS は、複雑な混合物の成分を検出および同定する方法としてプロテオミクスで使用されます。ボトムアップ プロテオミクスLC-MS アプローチでは、一般的に、プロテアーゼとしてトリプシン、三次構造を変性させる尿素、システイン残基を修飾するヨードアセトアミドを使用したプロテアーゼ消化と変性が含まれます。消化後、LC-MS はペプチド質量フィンガープリンティングに使用されるか、LC-MS/MS (タンデム MS ) ^{[ 32 ]}は個々のペプチドの配列を導出するために使用されます。^{[ 33 ]} LC-MS/MS は、高分解能質量分析でもペプチド質量が重なる可能性がある複雑なサンプルのプロテオミクス分析に最も一般的に使用されます。ヒト血清などの複雑な生物学的材料のサンプルは、1000 を超えるタンパク質を同定できる最新の LC-MS/MS システムで分析できます。しかし、このような高レベルのタンパク質同定は、SDS-PAGEゲルまたはHPLC-SCXによるサンプルの分離後にのみ可能です。^{[ 31 ]}最近では、LC-MS/MSがペプチドバイオマーカーの探索に用いられています。例としては、4つの主要な細菌性呼吸器病原体（黄色ブドウ球菌、モラクセラ・カタラーリス、インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌）およびSARS-CoV-2ウイルスのペプチドバイオマーカーの最近の発見と検証が挙げられます。^{[ 34 ] [ 35 ]}

LC-MS は、血漿、血清、尿などの生体組織のグローバルな代謝物プロファイリングにおいて最も一般的に使用される技術の 1 つとして登場しました。^{[ 36 ]} LC-MS は、天然物の分析や植物の二次代謝物のプロファイリングにも使用されます。 ^{[ 37 ]}この点において、MS ベースのシステムは、複雑な生体サンプルから幅広い化合物のより詳細な情報を取得するのに役立ちます。LC-核磁気共鳴 ( NMR ) も植物メタボロミクスで使用されますが、この技術は最も豊富な代謝物のみを検出および定量できます。LC-MS は、植物メタボロミクスの分野を進歩させるのに役立っており、植物メタボロミクスは、植物の環境に対する植物メタボロームの偏りのない特性評価を分子レベルで提供することを目的としています。 ^{[ 38 ]}植物メタボロミクスにおける LC-MS の最初の応用例は、キュウリ(Cucurbita maxima)の師部組織から、極性の高い代謝物、オリゴ糖、アミノ酸、アミノ糖、糖ヌクレオチドの広範囲の検出でした。 ^{[ 39 ]}植物メタボロミクスにおける LC-MS のもう 1 つの例は、シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)の葉抽出物からグルコース、スクロース、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコースを効率的に分離および同定することです。^{[ 40 ]}

LC-MSは、分子量の確認と構造の同定を迅速に行えるため、医薬品開発で頻繁に使用されています。これらの機能により、潜在的な用途を持つ膨大な製品群から出発して、発見の生成、試験、検証のプロセスが加速されます。医薬品開発におけるLC-MSアプリケーションは、ペプチドマッピング、糖タンパク質マッピング、脂質解析、天然物デレプリケーション、バイオアフィニティスクリーニング、in vivo薬物スクリーニング、代謝安定性スクリーニング、代謝物同定、不純物同定、定量的バイオ分析、および品質管理に使用される高度に自動化された方法です。^{[ 41 ]}