高速液体クロマトグラフィー

高速液体クロマトグラフィー（HPLC ）は、以前は高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれていましたが、混合物中の特定の成分を分離、識別、定量化するために使用される分析化学の技術です。混合物は、液体溶液に溶解された食品、化学物質、医薬品、^[1] 生物、環境、農業などに由来する可能性があります。^[要出典]

これは高圧ポンプに依存しており、移動相と呼ばれる様々な溶媒の混合物を送り、システム内を流れ、途中でサンプル混合物を収集し、固定相と呼ばれる吸着材料で作られた固体粒子で満たされたカラムと呼ばれるシリンダーに送ります。[ ^2]

サンプル中の各成分は吸着剤と異なる方法で相互作用し、各成分の移動速度が異なります。^[3]これらの異なる速度により、種がカラムからUV検出器などの特定の検出器に流れ込むときに分離が起こります。検出器の出力はクロマトグラムと呼ばれるグラフです。クロマトグラムは、信号強度と時間または体積の関係をグラフで表したもので、サンプルの成分を表すピークが表示されます。各サンプルは、保持時間と呼ばれるそれぞれの時間に現れ、面積はその量に比例します。^[2]

HPLCは、製造（医薬品や生物学的製剤の製造工程など） ^{[4] [5]}法務（尿中のパフォーマンス向上薬の検出など） ^[6]研究（複雑な生物学的サンプルの成分や類似の合成化学物質の成分を分離など）および医療（血清中のビタミンD濃度の検出など）の目的で広く使用されています。^[7]

クロマトグラフィーは、吸着および/または分配を伴う物質移動プロセスとして説明できます。前述のように、HPLC では、ポンプを使用して加圧液体とサンプル混合物を吸着剤で満たされたカラムに通し、サンプル成分を分離します。カラムの有効成分である吸着剤は、通常、1.5～50 μm の大きさの固体粒子 (シリカ、ポリマーなど) でできた粒状の材料で、さまざまな試薬を結合できます。^{[8] [9]}サンプル混合物の成分は、吸着剤粒子との相互作用の度合いが異なるため、互いに分離されます。加圧液体は通常、溶媒 (水、緩衝液、アセトニトリル、メタノールなど)の混合物であり、「移動相」と呼ばれます。その組成と温度は、サンプル成分と吸着剤の間で起こる相互作用に影響を与えることで、分離プロセスに大きな役割を果たします。^[10]これらの相互作用は、疎水性（分散性）、双極子間相互作用、イオン性など物理的な性質を持ち、ほとんどの場合はこれらの組み合わせです。^{[11] [12]}

液体クロマトグラフは複雑で^[13]、高度で繊細な技術です。システムを適切に操作するには、不正確なデータや歪んだ結果を避けるために、装置がどのようにデータ処理を行うかを理解するための最低限の基礎が必要です。^{[14] [15] [16]}

HPLC は、従来の (「低圧」)液体クロマトグラフィーとは動作圧力がかなり高い (約 50～1400 bar) ため区別されます。一方、通常の液体クロマトグラフィーは、移動相を充填カラムに通すために重力に頼るのが一般的です。分析 HPLC で分離されるサンプル量が少ないため、一般的なカラム寸法は直径 2.1～4.6 mm、長さ 30～250 mm です。また、HPLC カラムは、より小さな吸着粒子 (平均粒子サイズ 1.5～50 μm) で作られています。これにより、混合物を分離する際の HPLC の分解能 (化合物を区別する能力) が優れており、クロマトグラフィー技術として人気があります。^{[引用が必要]}

HPLC 機器の概略図には、通常、溶媒リザーバー、1 つ以上のポンプ、溶媒脱気装置、サンプラー、カラム、および検出器が含まれます。溶媒は、分離のニーズに応じて事前に準備され、脱気装置を通過して溶解ガスが除去され、混合されて移動相になり、次にサンプラーを通過してサンプル混合物が移動相ストリームに運ばれ、次にカラムに運ばれます。ポンプは、移動相の必要な流量と組成をカラム内の固定相に送り、次に検出器内のフローセルに直接送ります。検出器は、カラムから出てくるサンプル成分の量に比例した信号を生成するため、サンプル成分の定量分析が可能になります。検出器は、成分の初期識別に役立つ、出現時間、保持時間も記録します。より高度な検出器は、UV-VISスペクトルや質量スペクトルなど、分析対象物の特性に固有の追加情報も提供し、その構造的特徴に関する洞察を提供します。これらの検出器は、UV/Vis、フォトダイオードアレイ（PDA）/ダイオードアレイ検出器、質量分析検出器など、一般的に使用されています。^{[引用が必要]}

デジタルマイクロプロセッサとユーザーソフトウェアが HPLC 機器を制御し、データ分析を提供します。HPLC 機器の機械式ポンプの一部のモデルは、複数の溶媒を時間とともに変化する比率で混合し、移動相に組成勾配を生成できます。ほとんどの HPLC 機器には、分離を実行する温度を調整できるカラムオーブンも備わっています。^{[引用が必要]}

分離および分析されるサンプル混合物は、個別の少量（通常はマイクロリットル）で、カラムを浸透する移動相の流れに導入されます。サンプルの成分はそれぞれ異なる速度でカラムを通過しますが、これは吸着剤、固定相との特定の物理的相互作用の関数です。各成分の速度は、その化学的性質、固定相（カラム内）の性質、および移動相の組成によって異なります。特定の分析対象物が溶出する（カラムから出てくる）時間は、その保持時間と呼ばれます。特定の条件下で測定された保持時間は、特定の分析対象物を識別する特性です。^{[引用が必要]}

さまざまなタイプのカラムが用意されており、粒子サイズ、多孔度、表面化学が異なる吸着剤が充填されています。粒子サイズの小さい充填材を使用すると、より高い操作圧力 (「背圧」) が必要になり、通常、クロマトグラフィー分解能(カラムから出てくる連続した分析対象物間のピーク分離の程度) が向上します。吸着剤粒子は、イオン性、疎水性、または極性の性質を持ちます。^{[引用が必要]}

液体クロマトグラフィーの最も一般的なモードは逆相であり、使用される移動相には、水または緩衝液とさまざまな有機溶媒（最も一般的なものはアセトニトリルとメタノール）の混和性の組み合わせが含まれます。一部の HPLC 技術では、無水移動相を使用します（以下の順相クロマトグラフィーを参照）。移動相の水性成分には、サンプル成分の分離を助けるために、酸（ギ酸、リン酸、トリフルオロ酢酸など）または塩が含まれる場合があります。移動相の組成は、クロマトグラフィー分析中に一定に保たれる（「アイソクラティック溶出モード」）か、または変化します（「グラジエント溶出モード」）。アイソクラティック溶出は通常、単純な混合物の分離に効果的です。グラジエント溶出は、固定相と移動相との相互作用が変化する複雑な混合物に必要です。これが、グラジエント溶出で移動相の組成が通常、低溶出強度から高溶出強度まで変化する理由です。移動相の溶出強度は分析物の保持時間に反映され、溶出強度が高いと溶出が速くなる（保持時間が短くなる）ためである。例えば、逆相クロマトグラフィーの典型的なグラジエントプロファイルは、5% アセトニトリル（水または水性緩衝液中）から始まり、5～25 分かけて 95% アセトニトリルまで直線的に増加する。移動相組成が一定である期間（プラトー）もグラジエントプロファイルの一部となる場合がある。例えば、移動相組成は 1～3 分間 5% アセトニトリルで一定に保たれ、その後直線的に 95% アセトニトリルまで増加する。^[要出典]

移動相の組成の選択は、さまざまなサンプル成分 (「分析物」) と固定相 (逆相 HPLC における疎水性相互作用など) との相互作用の強さによって異なります。分析物は、固定相と移動相に対する親和性に応じて、カラム内で行われる分離プロセス中に 2 つの相の間で分配されます。この分配プロセスは、液液抽出中に発生するものと似ていますが、段階的ではなく連続的です。^{[引用が必要]}

水/アセトニトリルグラジエントを使用した例では、疎水性成分ほど遅く溶出（カラムから外れ）し、移動相のアセトニトリル濃度が高くなると（つまり、移動相の溶出溶液が高くなると）、それらの溶出が速まります。^{[引用が必要]}

移動相成分、添加剤（塩や酸など）、グラジエント条件の選択は、カラムとサンプル成分の性質によって異なります。適切な分離が得られる HPLC 法を見つけるために、サンプルで一連の試験運転が行われることがよくあります。^{[引用が必要]}

HPLC が登場する前、科学者はベンチトップのカラム液体クロマトグラフィー技術を使用していました。液体クロマトグラフィーシステムは、溶媒の流量が重力に依存するため、非常に非効率的でした。分離には数時間、時には数日かかりました。当時のガスクロマトグラフィー(GC) は液体クロマトグラフィー(LC) よりも強力でしたが、極性の高い高分子バイオポリマーの気相分離と分析は不可能であることは明らかでした。^[17] GC は、バイオ分子の多くの生命科学および健康アプリケーションには効果的ではありませんでした。なぜなら、バイオ分子は大部分が非揮発性であり、GC の高温では熱的に不安定だからです。^[18]その結果、すぐに HPLC の開発につながる代替方法が仮説として立てられました。^[要出典]

1941 年の Martin と Synge の画期的な研究に続いて、 1960 年代にCalvin Giddings、^[19] Josef Huber らは、充填粒子の直径を LC (および GC) の一般的なレベルである 150 μm よりも大幅に小さくし、圧力を使用して移動相速度を上げることで、LC を高効率モードで操作できることを予測しました。^[17]これらの予測は、60 年代から 70 年代にかけて、今日に至るまで広範囲にわたる実験と改良が行われました。^[20]初期の開発研究では、歴史的な表面多孔質粒子である Zipax などの LC 粒子の改良が始まりました。^[21]

1970年代には、ハードウェアと計測機器の多くの開発が行われました。研究者は、ポンプとインジェクターを使用してHPLCシステムの基本的な設計を開始しました。^{[22]ガスアンプポンプは、一定の}圧力で動作し、安定した流れと良好な定量のために漏れのないシールやチェックバルブを必要としないため、理想的でした。^[18]デュポンIPD（工業用ポリマー部門）では、低滞留容量グラジエントデバイスの使用や、セプタムインジェクターのループインジェクションバルブへの置き換えなど、ハードウェアのマイルストーンが達成されました。^[18]

機器の開発も重要でしたが、HPLCの歴史は主に粒子技術の歴史と進化に関するものです。^{[18] [23]}多孔質層粒子の導入後、効率を向上させるために粒子サイズを小さくする傾向が着実に見られました。^[18]しかし、粒子サイズを小さくすることで、新しい問題が発生しました。実用的な欠点は、移動性流体をカラムに通すために必要な過度の圧力降下と、非常に細かい材料の均一な充填を準備することが困難であることに起因しています。^[24]粒子サイズが大幅に小さくなるたびに、通常、圧力に対処するために機器の開発をもう一度行う必要があります。^{[20] [18]}

分配クロマトグラフィーは化学者が開発した最初のクロマトグラフィーの一種で、今日ではほとんど使用されていない。^[25]分配係数原理は、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、気相および液液分離の用途に応用されている。1952年のノーベル化学賞は、アミノ酸の分離に使用したこの技術の開発により、アーチャー・ジョン・ポーター・マーティンとリチャード・ローレンス・ミリントン・シングに授与された。^[26]分配クロマトグラフィーは、ペーパークロマトグラフィーと同様に「不活性」な固体支持マトリックスの表面または粒子または繊維内に保持された溶媒を使用するか、固定相とのクーロン相互作用および/または水素供与性相互作用を利用する。分析対象分子は、液体固定相と溶出液の間で分配される。親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC、HPLC内のサブ技術）と同様に、この方法は、極性の違いに基づいて分析対象を分離する。 HILICでは、極性固定相と、主にアセトニトリルと水を強成分とする移動相が最もよく使用されます。パーティションHPLCは、歴史的に非結合シリカまたはアルミナ支持体上で使用されてきました。それぞれは、相対的な極性の違いによって分析対象物を分離するのに効果的に機能します。HILIC結合相には、 1回のクロマトグラフィーで酸性、塩基性、中性溶質を分離できるという利点があります。^[27]

極性分析物は、極性固定相に関連する固定水層に拡散し、保持されます。極性分析物と極性固定相の間の相互作用が（移動相に対して）強いほど、溶出時間は長くなります。相互作用の強さは、分析物の分子構造の官能基部分に依存し、極性基（例：ヒドロキシル基）および水素結合が可能な基が多いほど、保持が強くなります。クーロン（静電）相互作用も保持を強めます。移動相に極性溶媒を使用すると、分析物の保持時間が短くなりますが、疎水性溶媒を使用すると保持時間が長くなる傾向があります。^{[引用が必要]}

順相クロマトグラフィーは化学者が開発した最初の種類の HPLC の 1 つですが、ここ数十年で使用が減少しています。順相 HPLC (NP-HPLC) としても知られるこの方法は、シリカなどの極性固定表面に対する親和性に基づいて分析物を分離します。つまり、分析物が吸着剤表面と極性相互作用 (水素結合や双極子間相互作用など) を起こす能力に基づいています。NP-HPLC は非極性、非水性の移動相 (クロロホルムなど) を使用し、非極性溶媒に容易に溶解する分析物を分離するのに効果的に機能します。分析物は極性固定相と結合して保持されます。吸着強度は分析物の極性が増加するにつれて増加します。相互作用強度は、分析物分子の構造に存在する官能基だけでなく、立体因子にも依存します。立体障害が相互作用の強度に及ぼす影響により、この方法では構造異性体を分離（分離）することができます。^[要出典]

移動相に極性溶媒を使用すると分析物の保持時間が短くなるのに対し、疎水性溶媒を使用すると溶出が遅くなる（保持時間が長くなる）傾向がある。移動相中の微量の水などの極性溶媒は固定相の固体表面に吸着して固定結合（水）層を形成し、これが保持に積極的な役割を果たすと考えられる。この挙動は、吸着メカニズムによってほぼ独占的に制御されるため、通常相クロマトグラフィーにやや特異である（つまり、分析物は吸着剤表面に付着したリガンドの溶媒和層ではなく固体表面と相互作用する。以下の逆相 HPLC も参照）。吸着クロマトグラフィーは、活性（乾燥）シリカまたはアルミナ支持体上のカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィー形式の両方で構造異性体の分離に今でも多少使用されている。^[要出典]

1970 年代に逆相HPLCが開発されたことで、分配型 HPLC と NP HPLC は人気がなくなりました。これは、シリカやアルミナのクロマトグラフィー媒体の表面に水やプロトン性有機溶媒の層が存在するため、保持時間の再現性が悪いためです。この層は移動相の組成 (水分レベルなど)の変化に応じて変化し、保持時間の変動を引き起こします。^{[引用が必要]}

最近、再現性が向上したヒリック結合相の開発と、この技術の有用性の範囲に対する理解が深まったことにより、分配クロマトグラフィーは再び人気が出てきました。

置換クロマトグラフィーの使用は限定的で、主に分取クロマトグラフィーに使用されています。基本原理は、クロマトグラフィーマトリックスに対する親和性の高い分子（置換剤）が結合部位を効果的に競合し、親和性の低いすべての分子を置換するために使用されます。^[28] 置換クロマトグラフィーと溶出クロマトグラフィーには明確な違いがあります。溶出モードでは、物質は通常、狭いガウスピークでカラムから出てきます。最大限の精製を達成するには、ピークの広い分離、できればベースラインまでの分離が望まれます。溶出モードで混合物の任意の成分がカラムを下る速度は、多くの要因に依存します。しかし、2 つの物質が異なる速度で移動し、それによって分離されるためには、生体分子とクロマトグラフィーマトリックス間の何らかの相互作用にかなりの差がなければなりません。操作パラメータは、この差の効果を最大化するように調整されます。多くの場合、ピークのベースライン分離は、グラジエント溶出と低いカラム負荷でのみ達成できます。したがって、溶出モードクロマトグラフィー、特に分取スケールの 2 つの欠点は、グラジエント溶媒ポンピングによる操作の複雑さと、カラム負荷が低いことによるスループットの低さです。置換クロマトグラフィーは、成分が「ピーク」ではなく、連続した純粋な物質のゾーンに分解される点で、溶出クロマトグラフィーよりも優れています。このプロセスは等温線の非線形性を利用するため、特定のカラムでより大きなカラムフィードを分離でき、精製された成分が著しく高い濃度で回収されます。^{[引用が必要]}

逆相HPLC（RP-HPLC）^[29]は、最も普及しているクロマトグラフィーのモードです。非極性固定相と水性の中程度の極性移動相があります。逆相法では、疎水性が高いほど物質がシステム内に保持されます。有機物質を保持するために、カラム内に充填された固定相は、主に球形のさまざまな形状の多孔質シリカゲル顆粒で構成され、さまざまな直径（1.5、2、3、5、7、10μm）とさまざまな孔径（60、100、150、300、Å）を持ち、その表面にはC3、C4、C8、C18などのさまざまな炭化水素リガンドが化学的に結合しています。極端なpHの溶液が必要な場合に固定相として機能するポリマー疎水性粒子や、有機物質と重合したハイブリッドシリカもあります。固定相上の炭化水素リガンドが長いほど、サンプル成分をより長く保持できます。現在のバイオメディカル材料の分離方法のほとんどは、C-18 タイプのカラムを使用しており、ODS (オクタデシルシラン) や RP-18 (逆相 18) などの商標名で呼ばれることもあります。

最も一般的な RP 固定相はシリカ担体をベースとしており、RMe ₂ SiCl を結合させることで表面が改質されています。ここで、R は C ₁₈ H ₃₇や C ₈ H ₁₇などの直鎖アルキル基です。

このような固定相では、親油性分子の保持時間は長くなりますが、極性分子はより容易に溶出します (分析の早い段階で現れます)。クロマトグラフィーでは、移動相に水をさらに追加することで保持時間を長くすることができ、疎水性分析物と疎水性固定相の相互作用が比較的強くなります。同様に、研究者は移動相に有機溶媒をさらに追加することで保持時間を短くすることができます。RP-HPLC は生物学者や生命科学のユーザーの間で非常に一般的に使用されているため、詳細を明記せずに単に「HPLC」と誤って呼ばれることがよくあります。製薬業界でも、発売前の医薬品の適格性確認に RP-HPLC を定期的に使用しています。^{[引用が必要]}

RP-HPLC は、双極性水構造の高度な対称性から生じ、生命科学のすべてのプロセスで最も重要な役割を果たしている疎水性相互作用の原理に基づいて動作します。RP-HPLC では、これらの相互作用力を測定できます。分析対象物質の固定相への結合は、固定相上のリガンドと結合した分析対象物質分子の非極性セグメントの周囲の接触表面積に比例します。この溶媒疎水性効果は、分析対象物質と C ₁₈鎖の周囲の「空洞縮小」に対する水の力と、両者の複合体に対する水の力によって支配されます。このプロセスで放出されるエネルギーは、溶離液の表面張力(水: 7.3 × 10 ⁻⁶  J /cm ²、メタノール: 2.2 × 10 ⁻⁶  J/cm ² ) と、分析対象物質とリガンドの疎水性表面にそれぞれ比例します。移動相に極性の低い溶媒（メタノール、アセトニトリル）を加えて水の表面張力を下げると、保持力を減らすことができます。グラジエント溶出では、分析中に水性移動相の極性と表面張力を自動的に下げることでこの効果を利用します。

分析対象分子の構造特性は、その保持特性において重要な役割を果たすことがあります。理論的には、疎水性表面積が大きい分析対象物 (C–H、C–C、および SS などの一般に非極性の原子結合) は、水構造と相互作用しないため、より長く保持されます。一方、極性表面積が大きい分析対象物 (構造内に -OH、-NH ₂、COO ⁻、-NH ₃ ⁺などの極性基が存在するため) は、水によく溶け込むため、保持されにくくなります。固定相との相互作用は、立体効果または排除効果によっても影響を受ける可能性があり、非常に大きな分子の成分は、表面リガンド (アルキル鎖) との相互作用が起こる固定相の細孔へのアクセスが制限される場合があります。このような表面障害により、通常は保持力が低下します。

分子の疎水性（非極性）表面積が大きいほど、保持時間は長くなります。たとえば、分岐鎖化合物は、全体の表面積が小さいため、対応する線状異性体よりも速く溶出できます。同様に、単一の C–C 結合を持つ有機化合物は、C=C または三重結合を持つ化合物よりも遅く溶出することがよくあります。これは、二重結合または三重結合によって、単一の C–C 結合よりも分子がコンパクトになるためです。

もう 1 つの重要な要素は移動相pHです。移動相pH によってイオン性分析物の疎水性特性が変化する可能性があるためです。このため、ほとんどの方法では、リン酸ナトリウムなどの緩衝剤を使用してpH を制御します。緩衝剤は、イオン性分析物のイオン化状態に影響を与える pH の制御、結合相リナンド間の固定相のイオン性シリカ表面の電荷への影響、場合によっては分析物の電荷を中和するイオン対形成剤としての働きなど、複数の目的を果たします。ギ酸アンモニウムは、質量分析において、分析物とアンモニウムの付加物の形成によって特定の分析物の検出を向上させるために一般的に添加されます。質量分析を使用してカラム流出物を分析する場合は、酢酸、または最も一般的にはギ酸などの揮発性有機酸が移動相に添加されることがよくあります。

トリフルオロ酢酸(TFA) は移動相への添加物として、主に UV ベースの検出器を使用して、主にペプチドとタンパク質である生物医学サンプルの複雑な混合物に広く使用されています。TFA は検出器と溶媒供給システムに残留物を残し、分析と検出を妨げる可能性があるため、質量分析法ではほとんど使用されません。ただし、TFA はかなり強力な有機酸であるため、UV-VIS などの他の検出器を使用するアプリケーションでは、カルボン酸などの分析対象物の保持を改善するのに非常に効果的です。酸とバッファーの効果はアプリケーションによって異なりますが、一般的にイオン化可能な成分を扱う場合はクロマトグラフィーの分解能が向上します。

逆相カラムは、結合した疎水性リガンドの遮蔽効果により、通常のシリカカラムに比べて損傷しにくいですが、ほとんどの逆相カラムはアルキル誘導体化シリカ粒子で構成されており、移動相の極端な pH 条件でシリカが加水分解される傾向があります。ほとんどのタイプの RP カラムは水性塩基と一緒に使用しないでください。水性塩基は、下にあるシリカ粒子を加水分解して溶解します。極端な pH 条件で使用できる RP カラムのハイブリッドまたは強化シリカベースの粒子の特定のブランドがあります。極端な酸性条件での使用も推奨されません。HPLC 装置の金属部品の内壁を加水分解したり腐食したりする可能性があるためです。

原則として、ほとんどの場合、RP-HPLC カラムは使用後に残留酸または緩衝液を除去するためにきれいな溶媒で洗い流し、適切な溶媒組成で保管する必要があります。一部のバイオメディカル アプリケーションでは、最適な分離のために非金属環境が必要です。このような敏感なケースでは、カラムの金属含有量をテストするために、2,2'- および 4,4'-ビピリジンの混合物であるサンプルを注入します。2,2'- ビピリジンは金属をキレート化できるため、金属イオンがシリカの表面に存在すると、2,2'- ビピリジンのピークの形状が歪んで (テール状に) なります。^{[引用が必要]}。

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）^[30]は、ポリマー分子と生体分子を分子サイズの違い（実際には粒子のストークス半径）に基づいて分離します。分離プロセスは、サンプル分子がカラム内に充填されたゲル球の細孔を透過する能力に基づいており、分析対象分子の相対的なサイズと吸収剤のそれぞれの細孔サイズに依存します。このプロセスは、充填材表面との相互作用がないことも前提としています。

SEC には通常、次の 2 つのタイプがあります。

1. ゲル浸透クロマトグラフィー (GPC) — 合成ポリマー (水性または有機可溶性) の分離。GPC は、主に有機溶媒を使用してポリマーの特性評価を行う強力な手法です。
2. ゲル濾過クロマトグラフィー (GFC) —水溶性バイオポリマーの分離。GFC では主に水性溶媒を使用します (通常はタンパク質などの水溶性バイオポリマー用)。

SEC の分離原理は、サンプルの高分子量物質がカラムを通過する際に多孔質固定相粒子に完全にまたは部分的に浸透することに基づいています。移動相溶出液は、固定相表面との相互作用を完全に防ぐように選択されます。これらの条件下では、分子のサイズが小さいほど、細孔空間内に浸透しやすくなり、カラムを通る移動に時間がかかります。一方、分子のサイズが大きいほど、分子が固定相の細孔に完全に浸透せず、細孔の周りを移動する可能性が高くなり、より早く溶出されます。分子は分子量の降順で分離され、最も大きな分子が最初にカラムから溶出し、より小さな分子が後で溶出します。細孔サイズよりも大きい分子は細孔にまったく入らず、クロマトグラムの最初のピークとして一緒に溶出します。これは、特定のカラムの排除限界を定義する総排除体積と呼ばれます。小さな分子は固定相粒子の細孔を完全に透過し、最後に溶出されてクロマトグラムの終わりを示し、総浸透マーカーとして現れることがあります。

生物医学では、SEC は一般に低解像度のクロマトグラフィーと見なされ、そのため精製の最終段階である「仕上げ」段階で使用されることが多いです。また、精製されたタンパク質の三次構造および四次構造を決定するのにも役立ちます。SEC は主に、タンパク質やポリマーなどの大きな分子の分析に使用されます。SEC は、粒子の細孔に小さな分子を捕捉することで、分取的にも機能します。大きな分子は細孔に入るには大きすぎるため、単に細孔を通り過ぎます。したがって、大きな分子は小さな分子よりも速くカラムを通過します。つまり、分子が小さいほど、保持時間が長くなります。

この技術は多糖類の分子量測定に広く用いられている。SECは市販されている様々な低分子量ヘパリンの分子量を比較するための公式技術（欧州薬局方により提案）である。^[31]

イオン交換クロマトグラフィー（IEC）またはイオンクロマトグラフィー（IC）^[32]は、金属産業、産業廃水、生物系、医薬品サンプル、食品などの環境および産業起源の水性サンプル中のイオン性溶質を分離および測定するための分析技術です。保持は、溶質イオンと固定相に結合した荷電部位との間の引力に基づいています。カラム上のイオンと同じ電荷を持つ溶質イオンは反発して保持されずに溶出しますが、カラムの荷電部位と反対の電荷を持つ溶質イオンはカラム上に保持されます。カラムに保持された溶質イオンは、塩濃度やpHを上げる、カラム温度を上げるなど、移動相の組成を変更することでカラムから溶出させることができます。

イオン交換体の種類には、ポリスチレン 樹脂、セルロースおよびデキストランイオン交換体（ゲル）、および細孔制御ガラスまたは多孔質シリカゲルがあります。ポリスチレン樹脂は架橋結合を可能にするため、鎖の安定性が向上します。架橋結合が高ければ曲がりが少なくなり、平衡時間が長くなり、最終的に選択性が向上します。セルロースおよびデキストランイオン交換体は、細孔サイズが大きく、電荷密度が低いため、タンパク質の分離に適しています。

一般に、イオン交換体は、より高い電荷とより小さな半径を持つイオンの結合を好みます。

対イオン（樹脂の官能基に対する）濃度が増加すると、溶質イオンとの強い競合が生じるため、保持時間が短縮されます。pH が低下すると陽イオン交換の保持時間が短縮され、pH が上昇すると陰イオン交換の保持時間が短縮されます。たとえば、陽イオン交換カラムの溶媒の pH を下げると、より多くの水素イオンが陰イオン固定相の位置を競い合うようになり、弱く結合した陽イオンが溶出されます。

この形式のクロマトグラフィーは、水の浄化、微量成分の濃縮、リガンド交換クロマトグラフィー、タンパク質のイオン交換クロマトグラフィー、炭水化物およびオリゴ糖の高 pH陰イオン交換クロマトグラフィーなどの用途で広く使用されています。

高性能アフィニティークロマトグラフィー（HPAC）^[33]は、固定化された生物学的に活性なリガンドを含む固定相が充填されたカラムにサンプル溶液を通すことで機能します。リガンドは、サンプル溶液中の標的分子に対して特異的な結合親和性を持つ基質です。標的分子はリガンドに結合し、サンプル溶液中の他の分子はカラムにほとんどまたはまったく保持されずに通過します。次に、標的分子は適切な溶出バッファーを使用してカラムから溶出されます。

このクロマトグラフィー プロセスは、結合した活性物質が特定のサンプル成分を生物学的に認識することで、安定した特異的かつ可逆的な複合体を形成する能力に依存しています。これらの複合体の形成には、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、双極子間相互作用、疎水性相互作用、水素結合などの一般的な分子力が関与しています。相補的な結合部位でこれらの力のいくつかが同時に協調して作用することで、効率的で生体特異的な結合が形成されます。

水性順相クロマトグラフィー（ANP ）は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC ）とも呼ばれます。^[34]これは、逆相クロマトグラフィー（RP）と有機順相クロマトグラフィー（ONP）の間の移動相領域を網羅するクロマトグラフィー技術です。HILICは、親水性化合物に対する独自の選択性を実現するために使用され、^[35]移動相に「逆相溶媒」、つまり比較的極性のある主に非水性溶媒を使用して、順相溶出順序を示します。^[34]多くの生物学的分子、特に生物学的流体中に見られるものは、逆相HPLCでは十分に保持されない小さな極性化合物です。このため、親水性相互作用LC（HILIC）は、極性分子の分析のための魅力的な代替アプローチであり、有用なアプローチとなっています。さらに、HILICはACNやメタノールなどの極性有機溶媒を含む従来の水性混合物で日常的に使用されるため、MSと簡単に組み合わせることができます。^[35]

移動相の組成が手順全体にわたって一定に保たれる分離法は、アイソクラティック（一定の組成を意味する）と呼ばれます。この言葉は、HPLCの先駆者の一人であるCsaba Horvathによって造られました。^{[36] [37]}

移動相の組成は一定である必要はありません。分離プロセス中に移動相の組成が変化する分離は、グラジエント溶出と呼ばれます。^{[38] [39]}たとえば、グラジエントは水中のメタノール濃度 10% で開始し、20 分後に水中のメタノール濃度 90% で終了します。移動相の 2 つの成分は、通常「A」と「B」と呼ばれます。Aは溶質がゆっくりとしか溶出しない「弱い」溶媒であり、Bは溶質をカラムから急速に溶出する「強い」溶媒です。逆相クロマトグラフィーでは、溶媒Aは水または水性緩衝液であることが多く、Bはアセトニトリル、メタノール、THF、イソプロパノールなどの水と混和する有機溶媒です。

アイソクラティック溶出では、ピーク幅は、理論段数 N の式に従って保持時間とともに直線的に増加します。これは、保持係数の広い範囲の分析対象物を含むサンプルを分析する場合、大きな欠点となる可能性があります。弱い移動相を使用すると、実行時間が長くなり、ゆっくり溶出するピークが広くなり、感度が低下します。強い移動相を使用すると、実行時間と後のピークの広がりの問題は改善されますが、ピーク分離が低下します。特に、完全に分離するのに十分な時間がない可能性がある、速く溶出する分析対象物の場合は顕著です。この問題は、グラジエント溶出の移動相組成を変更することで解決されます。

グラジエント溶出では、弱い移動相から始めて実行中に強くすることで、後から溶出する成分の保持力を減らして溶出を早め、ほとんどの成分のピークを狭く (高く) すると同時に、先に溶出する成分を適切に分離することができます。また、有機溶出液の濃度が上昇するとピークのテーリング部分が前方に押し出されるため、テーリング ピークのピーク形状も改善されます。これによりピークの高さも増加します (ピークが「シャープ」に見えます)。これは微量分析で重要です。グラジエント プログラムには、有機成分の割合を突然「段階的に」増加させたり、異なる時間に異なる傾斜を持たせたりすることが含まれます。これらはすべて、最短時間で最適な分離を行うという要望に応じて行われます。

アイソクラティック溶出では、カラム寸法（長さと内径）が変化しても保持順序は変化しない。つまり、ピークは同じ順序で溶出する。しかし、グラジエント溶出では、寸法や流量が変化すると溶出順序が変化する可能性がある。変化に応じてスケールダウンまたはスケールアップしない場合は^[40]

逆相クロマトグラフィーの原動力は、水の構造の高秩序に由来します。移動相の有機成分の役割は、この高秩序を低下させ、水性成分の遅延強度を低下させることです。

高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）の理論は、本質的には一般的なクロマトグラフィー理論と同じです。^{[41]この理論は、USP薬局方[42]}に見られるように、システム適合性試験の基礎として使用されており、これはHPLCシステムが分析のどの段階でも必要な分析に適合しているかどうかを試験する一連の定量的基準です。

この関係は、保持係数または保持パラメータと呼ばれる正規化された単位のない係数としても表されます。これは、性能基準の図にも示されているように、容量比の実験的測定値です。t _Rは特定の成分の保持時間であり、t ₀は保持されない物質が保持されることなくシステムから溶出するのにかかる時間であるため、ボイドタイムと呼ばれます。

クロマトグラム内の隣接する 2 つのピークの保持係数 k' の比率は、それらのピーク間の分離の程度の評価に使用され、パフォーマンス基準グラフに示すように 選択係数α と呼ばれます。

システム効率の基準としてのプレート数 N は、アイソクラティック条件、すなわち実行中ずっと移動相の組成が一定である条件向けに開発されたものです。クロマトグラフィー実行中に移動相が時間とともに変化するグラジエント条件では、システム効率の尺度としてパラメータピーク容量 P _{c を}^{使用する方が適切です。 [43]クロマトグラフィーにおける}ピーク容量の定義は、特定の定義済み分解能係数（通常は約 1）に対して保持時間内に分離できるピークの数です。また、ピークの平均幅の数で測定された実行時間として考えることもできます。この式は、性能基準の図に示されています。この式で、tg はグラジエント時間、w(ave) はベースでの平均ピーク幅です。

パラメータは主に、プレート理論（分配クロマトグラフィーの一部）とクロマトグラフィーの速度理論/ファン・ディームター方程式という 2 つのクロマトグラフィー理論から導き出されます。もちろん、これらは HPLC クロマトグラムの分析を通じて実践できますが、速度理論の方がより正確な理論であると考えられています。

これらは、ペーパークロマトグラフィー分離の保持係数の計算に似ていますが、HPLC が混合物をクロマトグラム上でピーク (バンド) として検出される 2 つ以上の成分にどれだけうまく分離するかを表します。HPLC パラメーターは、効率係数 ( N )、保持係数 (カッパプライム)、および分離係数 (アルファ) です。これらの係数は、2 つの成分のピークがどれだけうまく分離または重なり合っているかを表す分解能方程式の変数です。これらのパラメーターは、主に HPLC 逆相分離と HPLC 順相分離を説明するためにのみ使用されます。これらの分離は、他の HPLC モード (イオン交換やサイズ排除など)よりも微妙な傾向があるためです。

空隙容量とは、カラム内で溶媒が占める空間の量です。カラムの内部充填材の外側にあるカラム内の空間です。空隙容量は、クロマトグラムで最初に検出された成分ピークとして測定されます。このピークは通常、サンプル混合物に存在していた溶媒です。理想的には、サンプル溶媒はカラムと相互作用することなくカラムを通過しますが、HPLC 溶媒とは区別して検出可能です。空隙容量は補正係数として使用されます。

効率係数 ( N ) は、クロマトグラム上の成分ピークの鋭さを、成分ピークの面積 (「保持時間」) とピークの最も広い点 (ベースライン) の幅の比率として実際に測定します。高く、鋭く、比較的狭いピークは、分離方法によって混合物から成分が効率的に除去されたこと、つまり効率が高いことを示します。効率は、使用する HPLC カラムと HPLC 方法に大きく依存します。効率係数は、プレート数、および「理論段数」と同義です。

保持係数(カッパプライム) は、混合物の成分がカラムに付着していた時間を測定し、クロマトグラムのピークの曲線の下の面積で測定します (HPLC クロマトグラムは時間の関数であるため)。各クロマトグラム ピークには独自の保持係数があります (たとえば、最初のピークの保持係数はカッパ1 )。この係数は、カラムの空隙容量によって補正できます。

分離係数 (アルファ) は、混合物の 2 つの隣接する成分 (つまり、クロマトグラム上の 2 つの隣接するバンド) がどれだけ良好に分離されたかの相対比較です。この係数は、隣接するクロマトグラム ピークのペアの保持係数の比率で定義され、カラムの空隙容量によって補正されることもあります。分離係数の値が 1.0 を超えるほど分離は良好で、約 2.0 を超えると分離に HPLC メソッドはおそらく不要になります。分解能方程式は 3 つの係数を関連付けており、効率と分離係数が高いほど HPLC 分離における成分ピークの分解能が向上します。

HPLCカラムの内径（ID）は重要なパラメータです。^[44]内径が小さいと溶質バンドの横方向拡散が減少するため、検出応答に影響を与える可能性があります。また、アイソクラティックモードとグラジエントモードの両方で、流量と注入量が使用される直径の小ささや大きさに比例して縮小または拡大されない場合、分離選択性にも影響を与える可能性があります。^[45]内径によって、カラムにロードできる分析対象物の量が決まります。通常、直径の大きいカラムは、後で使用するための医薬品の精製などの分取用途で使用されます。^[46]低IDカラムは、最近の超高性能液体クロマトグラフィー（UHPLC）で感度が向上し、溶媒消費量が少なくなっています。^[47]

より大きな ID カラム (10 mm 以上) は、負荷容量が大きいため、使用可能な量の材料を精製するために使用されます。

分析スケールカラム（4.6mm）は最も一般的なタイプのカラムですが、より細いカラム^{[47]の人気が急速に高まっています。これらはサンプルの従来の定量分析に使用され、多くの場合、} UV-Vis吸光度検出器が使用されます。

狭口径カラム（1～2 mm）は、特殊なUV-vis検出器、蛍光検出、または液体クロマトグラフィー質量分析法などの他の検出方法でより高い感度が求められる用途に使用されます。

キャピラリーカラム（0.3 mm 未満）は、質量分析などの代替検出手段でのみほぼ独占的に使用されます。通常、キャピラリーカラムは、大型のカラムで使用されるステンレス鋼のチューブではなく、 溶融シリカのキャピラリーで作られています。

従来のHPLCのほとんどは、小さな球状シリカ粒子（非常に小さなビーズ）の外側に固定相を取り付けて行われます。これらの粒子にはさまざまなサイズがありますが、最も一般的なのは5μmのビーズです。粒子が小さいほど、一般に表面積が大きくなり、分離が向上しますが、最適な線速度を得るために必要な圧力は、粒子直径の2乗に反比例して増加します。^{[48] [49] [50]}

カラム速度、効率、背圧の式^[51]によれば、粒子径を半分に減らし、カラムのサイズを同じに保つと、カラム速度と効率は2倍になりますが、背圧は4倍に増加します。また、粒子が小さいHPLCでは、幅の広がりも減少します。^[52]より大きな粒子は、分取HPLC（カラム径5cmから30cm超）や固相抽出などのHPLC以外の用途に使用されます。

多くの固定相は、より大きな表面積を提供するために多孔質になっています。孔が小さいほど表面積は大きくなりますが、孔のサイズが大きいほど、特に大きな分析対象物の場合、反応速度が向上します。たとえば、孔よりわずかに小さいタンパク質は孔に入ることはあっても、いったん中に入ると簡単には出られません。

ポンプの圧力容量は様々ですが、その性能は、一定かつ再現性のある体積流量を生み出す能力によって測定されます。圧力は60 MPa (6000 lbf/in ² )、つまり約 600 気圧に達することもあります 。現代の HPLC システムは、はるかに高い圧力で動作するように改良されており、そのため、カラムで使用する粒子サイズがはるかに小さくなっています (<2 μm)。これらの「超高性能液体クロマトグラフィー」システムまたは UHPLC は、超高圧クロマトグラフィー システムとも呼ばれ、^[53]最大 120 MPa (17,405 lbf/in ² )、つまり約 1200 気圧で動作できます。^{[54] 「UPLC」 [55]}という用語は、ウォーターズ コーポレーションの商標ですが、UHPLC のより一般的な技術を指すために使用されることもあります。

HPLC 検出器は、ユニバーサルと選択の 2 つの主なカテゴリに分類されます。ユニバーサル検出器は通常、移動相と溶質を含む移動相の物理的特性の差を測定することでバルク特性 (例:屈折率) を測定しますが、選択検出器は、溶質の物理的または化学的特性に単純に反応することで溶質特性 (例: UV-Vis 吸光度) を測定します。^{[56] HPLC では、} UV-Vis 吸光度検出器が最も一般的に使用されますが、他のさまざまなクロマトグラフィー検出器も使用できます。UV-Vis 吸光度検出を補完するユニバーサル検出器は、荷電エアロゾル検出器(CAD) です。一般的に使用される検出器の一種に屈折率検出器があり、これは、溶出液がフローセルを通過するときに屈折率の変化を測定することで読み取り値を提供します。場合によっては、複数の検出器を使用することもできます。たとえば、LCMS では通常、UV-Vis と質量分析計を組み合わせています。

HPLC-ECDは電気化学検出器（ECD）と併用することで、神経化学分析研究用途においてノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、グルタミン酸、GABA、アセチルコリンなどの神経伝達物質を選択的に検出します。 ^[57] HPLC-ECDはフェムトモル範囲の神経伝達物質を検出します。神経伝達物質を検出する他の方法としては、液体クロマトグラフィー質量分析法、ELISA、放射免疫測定法などがあります。

HPLCオートサンプラーを使用することで、大量のサンプルをHPLCシステムに自動的に注入することができます。さらに、HPLCオートサンプラーは、注入量と注入方法が各注入でまったく同じであるため、注入量の精度が非常に高くなります。サンプルをサンプリングチャンバー内で撹拌することも可能で、均一性が向上します。^[58]

HPLCは、実験室科学と臨床科学の両方で多くの用途があります。製品の純度を確保するための信頼できる方法であるため、医薬品開発でよく使用される技術です。^[59] HPLCは非常に高品質（純粋）な製品を生産できますが、バルク医薬品原料の製造に使用される主な方法とは限りません。^[60]欧州薬局方によると、HPLCは合成のわずか15.5％に使用されています。^[61]しかし、米国薬局方では合成の44％でHPLCが使用されています。^[62]これは、大規模なHPLCは高価な技術になる可能性があるため、金銭的および時間的制約の違いによる可能性があります。HPLCで実現される特異性、精度、正確性の向上は、残念ながらコストの増加に相当します。

この技術は、様々なサンプル中の違法薬物の検出にも使用されている。 ^{[63]薬物検出の最も一般的な方法は}免疫測定法である。^[64]この方法ははるかに便利です。しかし、便利さは特異性と広範囲の薬物のカバー率を犠牲にするため、代替方法としてHPLCが使用されてきました。HPLCは純度を決定（および場合によっては増加）する方法であるため、薬物の濃度を評価するためにHPLCのみを使用するのはやや不十分でした。したがって、この文脈でのHPLCは、質量分析と組み合わせて実行されることがよくあります。^[65]ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）の代わりに液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）を使用すると、面倒な追加手順となる可能性があるアセチル化剤またはアルキル化剤による誘導体化の必要性を回避できます。^[66] LC-MSは、ドーピング剤、薬物代謝物、グルクロン酸抱合体、アンフェタミン、オピオイド、コカイン、BZD、ケタミン、LSD、大麻、農薬など、さまざまな物質の検出に使用されています。^{[67] [68]} HPLCを質量分析と組み合わせて実行すると、HPLC実験の実行を標準化する必要性が絶対に減ります。

同様の分析法は研究目的でも実施でき、抗真菌薬や喘息薬などの潜在的な臨床候補物質の濃度を検出することができる。^[69]この技術は、採取したサンプル中の複数の種を観察するのにも明らかに有用であるが、種の同定に関する情報を求める場合には標準溶液の使用が必要となる。このタイプの研究では純度が不可欠であるため、合成反応の結果を確認する方法として使用されている。しかし、質量分析法は依然として種を同定するより信頼性の高い方法である。

HPLCの医療用途では、通常、検出器として質量分析計（MS）を使用するため、この技術はLC-MS ^[70]または2種類のMSが連続して操作されるタンデムMSのLC-MS/MSと呼ばれます。^[71] HPLC機器が複数の検出器に接続されている場合、ハイフン付きLCシステムと呼ばれます。^[要出典]医薬品用途^[72]は、HPLC、LC-MS、およびLC-MS/MSの主なユーザーです。^[73]これには、医薬品開発^[74]や薬理学（薬物や化学物質が生体に及ぼす影響の科学的研究）、^[75]個別化医療^[76]、[77]公衆衛生^{[ 78]}および診断が含まれます。^[79]尿は薬物濃度を分析するための最も一般的な媒体ですが、血清はHPLCを使用したほとんどの医療分析で収集されるサンプルです。^[80]臨床検査室におけるLC-MSとLC-MS/MSの最も重要な役割の一つは、代謝障害^[81]とフォローアップ診断のための新生児スクリーニング（NBS）である。^{[82] [83]}乳児のサンプルは乾燥血液スポット（DBS）の形で提供され、^[84]準備と輸送が簡単で、地域的にも世界的にも安全でアクセスしやすい診断を可能にする。

臨床研究に有用な分子検出の他の方法は、HPLCに対してテストされてきました。すなわち免疫測定です。その一例では、競合タンパク質結合アッセイ（CPBA）とHPLCがビタミンDの検出感度について比較されました。小児のビタミンD欠乏症の診断に有用なこのCPBAの感度と特異性は、HPLCの能力のそれぞれ40％と60％にしか達しないことがわかりました。^[85]高価なツールではありますが、HPLCの精度はほぼ比類がありません。

• クロマトグラフィーの歴史
• キャピラリー電気クロマトグラフィー
• カラムクロマトグラフィー
• チャバ・ホルヴァート
• イオンクロマトグラフィー
• ミセル液体クロマトグラフィー

• LR Snyder、JJ Kirkland、JW Dolan、「現代液体クロマトグラフィー入門」、John Wiley & Sons、ニューヨーク、2009 年。
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• LR Snyder、JJ Kirkland、JL Glajch、「実践的 HPLC メソッド開発」、John Wiley & Sons、ニューヨーク、1997 年。
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ウィキメディア・コモンズには、高性能液体クロマトグラフィーに関連するメディアがあります。

• HPLCクロマトグラフィーの原理、応用[基本ノート] – 2020. at Rxlalit.com ^{[ permanent dead link ‍ ]}