向流クロマトグラフィー

向流クロマトグラフィー（CCC、または向流クロマトグラフィー）は、液体-液体クロマトグラフィーの一種で、液体の固定相を使用する。液体の固定相は、求心力により遠心分離機の中心に向かって加速する固定相を構成する分子の慣性によって所定の位置に保持され^{[1] 、}混合物の化学成分を分離、識別、および定量するために使用される。 広義には、向流クロマトグラフィーは、固体支持体なしで2つの混ざらない液相を使用する一連の関連する液体クロマトグラフィー技術を包含する。 ^{[1] [2]}少なくとも1つの相が、両方の相を含むカラム、中空チューブ、またはチャネルに接続された一連のチャンバーを介してポンプで送られると、2つの液相が互いに接触する。 結果として生じる動的な混合および沈降作用により、2つの相におけるそれぞれの溶解度によって成分を分離することができる。 少なくとも2つの混ざらない液体で構成される多種多様な2相溶媒システムを使用して、目的の分離に適切な選択性を提供することができる。^{[3] [4]}

デュアルフローCCCなどの一部のタイプの向流クロマトグラフィーは、2つの混ざらない相が互いを通り過ぎてカラムの反対側の端から出る、真の向流プロセスを特徴としています。^[5]しかし、多くの場合、1つの液体が固定相として機能し、移動相がポンプで送られる間、カラム内に保持されます。液体の固定相は、重力、または固定相を構成する分子が求心力により遠心分離機の中心に向かって加速する慣性によって所定の位置に保持されます。重力法の例は、液滴向流クロマトグラフィー（DCCC）と呼ばれます。^{[6]固定相が求心力によって保持されるモードには、}静水圧と流体力学の2つがあります。静水圧法では、カラムは中心軸を中心に回転します。^[7]静水圧機器は、遠心分配クロマトグラフィー（CPC）という名前で販売されています。^[8]流体力学的装置は、カラム内の固定相を保持するためにらせんコイル内のアルキメデスのねじ力を利用する高速または高性能向流クロマトグラフィー（それぞれHSCCCおよびHPCCC）装置として販売されることが多い。 ^[9]

CCC システムのコンポーネントは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)などのほとんどの液体クロマトグラフィー構成と同様です。1 つ以上のポンプが、CCC 機器自体であるカラムに相を送ります。サンプルは、自動または手動のシリンジが入ったサンプル ループを通じてカラムに導入されます。流出は、紫外可視分光法や質量分析法などのさまざまな検出器で監視されます。ポンプ、CCC 機器、サンプル注入、および検出の操作は、手動またはマイクロプロセッサで制御できます。

現代の向流クロマトグラフィーの理論と実践の前身は、向流分布（CCD）でした。CCDの理論は、1930年代にランドールとロンティンによって説明されました。^[10] アーチャー・マーティンとリチャード・ローレンス・ミリントン・シングは、 1940年代にこの方法論をさらに発展させました。^[11]最後に、ライマン・C・クレイグは、 1944年にクレイグ向流分布装置を発表し、CCDを実験室での作業に実用化しました。^[12] CCDは、数十年にわたってさまざまな有用な化合物の分離に使用されました。^[13]

標準的なカラムクロマトグラフィーは固体固定相と液体移動相から構成され、ガスクロマトグラフィー(GC) は固体支持体上の固体または液体固定相と気体移動相を使用する。対照的に、液液クロマトグラフィーでは、移動相と固定相の両方が液体である。しかし、この対比は一見したほど鮮明ではない。例えば、逆相クロマトグラフィーでは、固定相は、ミクロ多孔性 シリカ固体支持体に化学結合によって固定化された液体とみなすことができる。向流クロマトグラフィーでは、求心力または重力によって固定液層が固定される。固体支持体を排除することで、カラムへの分析物の永久吸着が回避され、分析物の高い回収率を達成することができる。^[14]向流クロマトグラフィー装置は、移動相と固定相を変更するだけで、順相クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーを簡単に切り替えることができる。カラムクロマトグラフィーでは、分離の可能性は市販の固定相媒体とその特定の特性によって制限される。固定相を正常に保持できる限り、 ほぼすべての混ざらない溶液の組み合わせを逆流クロマトグラフィーで使用できます。

溶媒コストも一般的にHPLCよりも低い。カラムクロマトグラフィーと比較すると、ほとんどの逆流クロマトグラフィー分離では、流量と総溶媒使用量を半分、さらには10分の1まで削減できる可能性がある。^[15]また、固定相媒体の購入と廃棄のコストも削減できる。逆流クロマトグラフィーのもう1つの利点は、実験室で行われる実験を工業用容量にスケールアップできることである。ガスクロマトグラフィーまたはHPLCを大容量で実行すると、表面積と体積の比率とフローダイナミクスの問題により分解能が失われるが、両方の相が液体であればこの問題は回避できる。^[16]

CCC 分離プロセスは、2 つの相の混合、沈殿、分離 (多くの場合は連続的に発生しますが) の 3 つの段階で発生すると考えられます。相間の界面積を最大化し、質量移動を高めるためには、相を激しく混合することが重要です。分析物は、分配係数、分配定数、または分配比とも呼ばれ、P、K、D、K _c、または K _Dで表される分配係数に従って相間に分配されます。^[17]特定の二相溶媒システムにおける分析物の分配係数は、機器の容量、流量、固定相保持容量比、および固定相を固定するために必要なg 力とは無関係です。固定相保持の程度は重要なパラメーターです。固定相保持に影響を与える一般的な要因は、流量、二相溶媒システムの溶媒組成、およびg 力です。固定相保持は固定相体積保持比（Sf）で表され、これは固定相の体積を装置の総体積で割ったものである。沈降時間は溶媒系とサンプルマトリックスの特性であり、どちらも固定相保持に大きな影響を与える。^[18]

ほとんどのプロセス化学者にとって、「逆流」という用語は、大型の遠心抽出装置で典型的に見られるように、2 つの混ざらない液体が反対方向に移動することを意味します。デュアル フロー (以下を参照) CCC を除き、ほとんどの逆流クロマトグラフィー操作モードには固定相と移動相があります。この状況でも、機器のカラム内では逆流が発生します。^[19] CCC と CPC の両方を液体-液体クロマトグラフィーに改名することを提案した研究者もいますが、^[20]「逆流」という用語自体が誤った名称であると考える研究者もいます。^[21]

カラムクロマトグラフィーやHPLCとは異なり、向流クロマトグラフィーではカラム容量に比べて大量の注入が可能です。^[22]通常、コイル容量の5～10%を注入できます。場合によっては、コイル容量の15～20%まで増やすことができます。^[23]通常、最新の市販のCCCおよびCPCは、5～40 g/Lの容量を注入できます。ターゲット、マトリックス、使用可能な二相性溶媒の種類が非常に異なるため、特定の機器であっても範囲が非常に広く、すべての機器オプションに当てはまるわけではありません。約10 g/Lがより一般的な値であり、ほとんどのアプリケーションで基本値として使用できます。

向流分離は、目的の分離に適した二相性溶媒系を選択することから始まります。CCC の実践者は、n-ヘキサン(またはヘプタン)、酢酸エチル、メタノール、水をさまざまな割合で組み合わせた幅広い二相性溶媒混合物を利用できます。^[24]この基本的な溶媒系は、HEMWat 溶媒系と呼ばれることもあります。^[要出典]溶媒系の選択は、CCC 文献を熟読することで導き出せます。最適な溶媒系を決定するために、薄層クロマトグラフィーの一般的な手法を使用することもできます。^[25]溶媒系を「ファミリー」に編成することで、溶媒系の選択も大幅に容易になりました。^[26]溶媒系は、1 つのフラスコの分配実験でテストできます。分配実験から測定された分配係数は、化合物の溶出挙動を示します。通常、対象化合物の分配係数が0.25 ～ 8 である溶媒系を選択することが望ましい。 ^[27]歴史的には、市販の向流クロマトグラフではイオン液体の高粘度に対応できないと考えられていた。しかし、30 ～ 70 % 以上のイオン液体（両方の相が適切にカスタマイズされたイオン液体であれば、潜在的には 100 % のイオン液体）を収容できる最新の機器が利用可能になった。^[28]イオン液体は、並外れた溶解性と特異性を持つようにカスタマイズできるため、極性/非極性有機、アキラルおよびキラル化合物、生体分子、無機分離用にカスタマイズできる。^[29]

二相性溶媒システムを選択した後、バッチを調合し、分液漏斗で平衡化します。このステップは、溶媒システムの事前平衡化と呼ばれます。2 つの相が分離されます。次に、ポンプを使用してカラムに固定相を充填します。次に、カラムを目的の回転速度などの平衡条件に設定し、移動相をカラムに送り込みます。移動相は、カラムの平衡が達成されて移動相がカラムから溶出するまで、固定相の一部を押しのけます。サンプルは、カラム平衡化ステップ中または平衡化が達成された後、いつでもカラムに導入できます。溶出液の容量がカラム内の移動相の容量を超えると、サンプル成分が溶出を開始します。分配係数が 1 の化合物は、注入時から 1 カラム容量の移動相が​​カラムを通過したときに溶出します。その後、化合物を別の固定相に導入して、結果の分解能を高めることができます。 ^[30]対象化合物が溶出された後、または固定相をカラムにポンプで送り込むことによってカラムが押し出された後に、流れが停止される。 逆流クロマトグラフィーの主な応用例としては、植物抽出物などの非常に複雑なマトリックスを採取し、慎重に選択された溶媒系で逆流クロマトグラフィー分離を行い、カラムを押し出してサンプル全体を回収することがあげられる。 元の複雑なマトリックスは、個別の狭い極性バンドに分画され、その後、化学組成または生物活性を分析することができる。 他のクロマトグラフィーおよび非クロマトグラフィー技術と組み合わせて1つ以上の逆流クロマトグラフィー分離を行うことで、非常に複雑なマトリックスの組成認識が急速に進歩する可能性が秘められている。^{[31] [32]}

液滴向流クロマトグラフィー（DCCC）は、1970年に谷村、ピサノ、伊藤、およびボウマンによって導入されました。^[33] DCCCは、直列に接続された長い垂直チューブに保持された固定相を介して移動相を移動させるために重力のみを使用します。下降モードでは、密度の高い移動相とサンプルの液滴は、重力のみを使用して軽い固定相のカラムを落下することができます。密度の低い移動相を使用すると、固定相を介して上昇します。これを上昇モードと呼びます。1つのカラムからの溶出液は別のカラムに移されます。使用するカラムの数が多いほど、理論段数を増やすことができます。DCCCは天然物の分離である程度成功を収めましたが、高速向流クロマトグラフィーの急速な発展によって大きく影を潜めました。^[34] DCCCの主な制限は、流量が低く、ほとんどのバイナリ溶媒システムで混合が不十分なことです。

CCC の現代は、伊藤洋一郎博士による惑星遠心分離機の開発から始まりました。これは、1966 年に「惑星」軸で回転する閉じた螺旋管として初めて導入されましたが、「太陽」軸で回転します。 ^[35]その後、フロースルー モデルが開発され、新しい技術は 1970 年に逆流クロマトグラフィーと呼ばれました。^[2]この技術は、クロロホルム、氷酢酸、0.1 M 水性塩酸(2:2:1 v/v) 溶媒システムでDNP アミノ酸のテスト混合物を使用することでさらに発展しました。 ^[36]相がコイルにポンプで送られている間、必要な惑星運動を維持できるように機器を設計するには、多くの開発が必要でした。^[37] 2 つの軸の相対回転 (同期または非同期)、コイルを通る流れの方向、ローター角度などのパラメーターが調査されました。^{[38] [39]}

1982年までに、この技術は十分に進歩し、「高速」向流クロマトグラフィー（HSCCC）と呼ばれるようになった。^{[40] [41]}ピーター・カルメシは、最初にPC Inc.のIto多層コイル分離/抽出装置を商品化した。これは、コイルが巻かれる単一のボビンとカウンターバランス、およびボビンを接続するチューブである「フライングリード」のセットを使用した。^[42]ウォルター・コンウェイ博士らは後にボビンの設計を進化させ、複数のコイル、さらには異なるチューブサイズのコイルを単一のボビンに配置できるようにした。^[43]エドワード・チョウは後に、3つのボビン間のリードのねじれを解くメカニズムを備えたPharmatech CCCとしてトリプルボビン設計を進化させ、商品化した。^[44] 1993年に発売されたQuattro CCCは、Pharmatechの複数のボビン間のねじれ解除機構を必要としない、新しいミラーイメージのツインボビン設計を利用して市販の機器をさらに進化させたため、同じ機器で複数のボビンを収容できました。^[45]現在、流体力学的CCCは、機器ごとに最大4つのコイルで利用できます。これらのコイルは、PTFE、PEEK、PVDF、またはステンレス鋼のチューブにすることができます。 2、3、または4つのコイルはすべて同じボアにすることができ、 "2D" CCC（下記参照）を容易にします。 コイルを直列に接続してコイルを長くして容量を増やすことも、コイルを並列に接続して2、3、または4つの分離を同時に行うこともできます。 コイルは、1つの機器で1〜6 mmの範囲で異なるサイズにすることもできます。最近では、フライングリードの代わりに、カスタムまたは標準オプションとして、さまざまな流体力学的CCC設計用の回転シールを備えた計器派生製品が提供されています。^{[46] [47] [48] [49] [50]}

CCC 装置の動作原理には、ボビンに巻き付けられたチューブからなるカラムが必要です。ボビンは 2 軸の旋回運動 (カーディオイド)で回転し、これにより、各回転中に可変のg 力がカラムに作用します。この運動により、カラムは 1 回転につき 1 つの分割ステップを経験し、サンプルの成分は 2 つの混ざらない液体相間の分割係数によりカラム内で分離します。「高性能」向流クロマトグラフィー (HPCCC) は、HSCCC とほぼ同じように機能します。7 年間の研究開発プロセスにより、HSCCC マシンの 80 g と比較して 240 g を生成する HPCCC 機器が開発されました。この g 力の増加とカラムのより大きなボアにより、移動相の流量が向上し、固定相の保持力が向上し、スループットが 10 倍に増加しました。^[51]逆流クロマトグラフィーは分取液体クロマトグラフィー技術であるが、高重力HPCCC装置の登場により、以前は数百ミリグラム必要だったサンプル負荷が数ミリグラムという低サンプル負荷で装置を操作することが可能になった。この技術の主な応用分野には、天然物の精製や医薬品開発などがある。^[52]

静水圧CCCまたは遠心分離分配クロマトグラフィー（CPC）は、1980年代に日本の三機エンジニアリング株式会社（社長：布垣寛一）によって発明されました。^{[8] [53]} CPCは、1990年代後半からフランスで広範囲に開発されてきました。フランスでは、最初に三機が始めた積層ディスクのコンセプトを最適化しました。最近では、フランスと英国で、PTFE、ステンレス鋼、またはチタンのローターを使用した非積層ディスクCPC構成が開発されました。これらは、元のコンセプトの積層ディスク間の漏れを克服し、適正製造規範のための蒸気洗浄を可能にするように設計されています。100 mlから12リットルまでの容量が、さまざまなローター素材で利用できます。25リットルローターCPCにはチタンローターが付いています。^[54]この技術は、「高速」CPCまたは「高性能」CPCという名前で販売されることがあります。

遠心分離クロマトグラフ装置は、カラムを内蔵する独自のローターで構成されています。このローターは中心軸を中心に回転します（HSCCCカラムは遊星軸を中心に回転し、同時に別の太陽軸を中心に偏心回転します）。振動と騒音が少ないCPCは、通常500～2000rpmの回転速度範囲を提供します。流体力学的CCCとは異なり、回転速度は固定相の保持容量比に直接比例しません。DCCCと同様に、CPCは下降モードまたは上昇モードで操作でき、方向は重力ではなくローターによって生成される力に相対します。より大きなチャンバーとチャネルを備えた再設計されたCPCカラムは、遠心分離分離抽出（CPE）と呼ばれています。^[55] CPE設計では、より速い流速とカラム負荷の増加を実現できます。

CPC は、分析装置 (数ミリリットル) から工業用装置 (数リットル) への直接スケールアップを可能にし、高速バッチ生産を実現します。CPC は、水性二相溶媒系に特に適しているようです。^[56]一般的に、CPC 機器は、相間の密度の差が小さいために流体力学機器では保持しにくい溶媒系を保持できます。^[57] CPC チャンバー内での混合と沈殿を引き起こす流れのパターンを、非同期カメラと CPC ローターによってトリガーされるストロボスコープで視覚化することは、CPC 機器の開発に非常に役立ちました。^[58]

前述の流体力学的および静水力学的装置は、科学者の特定の分離ニーズに対応するために、さまざまな方法、つまり操作モードで使用できます。向流クロマトグラフィー技術の長所と可能性を活用するために、多くの操作モードが考案されています。一般に、市販の装置を使用して、次のモードを実行できます。

順相溶出は、非水性相または二相性溶媒系の相を移動相としてカラムに送り込み、より極性の固定相をカラム内に保持することによって達成されます。 の元の命名法の理由は関連しています。ペーパークロマトグラフィーの元の固定相が珪藻土(天然の微細孔シリカ)などのより効率的な材料に取って代わられ、その後に現代のシリカゲルが続いたため、薄層クロマトグラフィーの固定相は極性 (シリカに結合したヒドロキシ基) であり、最大の保持はn-ヘキサンなどの非極性溶媒で達成されました。 その後、極性化合物をプレート上に移動させるために、次第に極性のより高い溶出液が使用されるようになりました。 さまざまなアルカン結合相が試され、C18 が最も人気になりました。 アルカン鎖がシリカに化学的に結合し、溶出傾向が逆転しました。 したがって、極性固定相は「順」相クロマトグラフィーになり、非極性固定相クロマトグラフィーは「逆」相クロマトグラフィーになりました。

逆相（水性移動相など）溶出では、極性の低い固定相とともに水相が移動相として使用されます。向流クロマトグラフィーでは、カラムを通る移動相の流れの方向を切り替えるだけで、同じ溶媒システムを順相モードまたは逆相モードのどちらでも使用できます。

分離実験の最後に回転を止めてカラムに溶媒またはガスを送り込むことによってカラムから固定相を押し出す方法は、EECCCという用語が提案される前からCCCの実践者によって使用されていました。^[59]溶出-押し出しモード（EECCC）では、回転を維持しながらシステムに送り込まれる相を切り替えることで、ある時点以降に移動相が押し出されます。^[60]たとえば、ある時点で移動相として水相を使用して分離が開始された場合、有機相がカラムに送り込まれ、切り替え時にカラム内に存在する両方の相が効果的に押し出されます。拡散による分解能の低下なしに、完全なサンプルが極性（正または逆）の順序で溶出されます。必要な溶媒相はカラム1容量のみで、次の分離のためにカラムは新鮮な固定相で満たされます。^[61]

溶媒グラジエントの使用はカラムクロマトグラフィーでは非常によく発達していますが、CCCではあまり一般的ではありません。溶媒グラジエントは、分離中に移動相の極性を増加（または減少）させることによって生成され、より広い範囲の極性にわたって最適な分解能を実現します。たとえば、ヘプタンを固定相として使用して、メタノール-水移動相グラジエントを使用することができます。これは、カラム内の平衡状態が崩れることによって固定相が過度に失われるため、すべての二相溶媒システムで可能というわけではありません。グラジエントは段階的に生成することも、^[62]連続的に生成することもできます。^[63]

デュアルモードでは、分離実験の途中で移動相と固定相が逆転します。このため、カラムに送られる相と流れの方向を変更する必要があります。^[64]デュアルモード操作では、サンプル全体がカラムから溶出する可能性がありますが、相と流れの方向を切り替えることで溶出の順序が乱れます。

デュアルフロー、またはデュアルとも呼ばれる逆流クロマトグラフィーは、カラム内で両相が反対方向に流れるときに発生します。流体力学的 CCC と静水力学的 CCC の両方でデュアルフロー操作用の機器が利用可能です。デュアルフロー逆流クロマトグラフィーは、1985 年に伊藤洋一郎によって、気液分離が行われるフォーム CCC 用に初めて説明されました。^[65]すぐに液液分離が続きました。^[66]逆流クロマトグラフィー機器は、カラムの両端に入口と出口の両方の機能があるように変更する必要があります。このモードでは、サンプルをカラムの中央または流体力学的機器の 2 つのボビンの間に導入することで、連続または連続分離に対応できます。^[67]間欠逆流抽出 (ICcE) と呼ばれる手法は、相の流れが「間欠的に」通常相と逆相の溶出の間で交互に行われるため、固定相も交互に行われる準連続方法です。^[68]

^{リサイクルクロマトグラフィーは、HPLC [69]と CCC [70]}の両方で実施さ​​れているモードです。リサイクルクロマトグラフィーでは、対象化合物は溶出後にカラムに再導入されます。カラムを通過するたびに、化合物が経験する理論段数が増加し、クロマトグラフィーの分解能が向上します。直接リサイクルは、アイソクラティック溶媒システムで行う必要があります。このモードでは、分離を容易にするために、溶出液は同じカラムまたは別のカラムで選択的に再クロマトグラフィーすることができます。^[71]この選択的リサイクルのプロセスは「ハートカット」と呼ばれ、回収率を犠牲にして選択した対象化合物を精製するのに特に効果的です。^[72]あるクロマトグラフィー実験から選択した画分を別のクロマトグラフィー法で再分離するプロセスは、科学者によって長い間実施されてきました。リサイクルおよびシーケンシャルクロマトグラフィーは、このプロセスの合理化されたバージョンです。CCC では、二相性溶媒システムの組成を変更するだけで、カラムの分離特性を変更できます。^[73]

従来のCCC実験では、装置に固定相を充填し、移動相で平衡化する前に、二相性溶媒系を予備平衡化する。予備平衡化後に両相を改変することにより、イオン交換モードが作成される。^[74]一般に、イオン性置換剤（または溶出剤）を移動相に追加し、イオン性保持剤を固定相に追加する。例えば、水性移動相には置換剤としてNaIを含めることができ、有機固定相は保持剤としてAliquat 336と呼ばれる第四級アンモニウム塩で改変することができる。 ^[75] pHゾーン精製と呼ばれるモードは、酸および/または塩基を溶媒修飾子として利用するイオン交換モードの一種である。^{[76]通常、分析物は}pKa値によって決定される順序で溶出される。例えば、ゲルセミウム・エレガンスの茎抽出物 4.5g から 6 種類のオキシンドールアルカロイドが、ヘキサン、酢酸エチル、メタノール、水 (3:7:1:9、v/v) からなる二相性溶媒系で単離されました。この溶媒系では、上部有機固定相に保持剤として 10 mMトリエチルアミン(TEA) を加え、水性移動相に溶出剤として 10 mM 塩酸 (HCl) を加えました。^[77] pH ゾーン精製などのイオン交換モードは、分離力を犠牲にすることなく高いサンプル負荷を実現できるため、大きな可能性を秘めています。これは、窒素含有アルカロイドやカルボン酸含有脂肪酸などのイオン化可能な化合物に最適です。^[78]

向流クロマトグラフィーおよび関連する液液分離技術は、さまざまな化学物質を精製するために、工業規模と実験室規模の両方で使用されています。 分離の実現には、タンパク質、^[79] DNA、^[80] 大麻由来のカンナビジオール（CBD）^[81]抗生物質、^[82]ビタミン、^{[83 ]}天然物、^[31]医薬品、^[52]金属イオン、^[84]農薬、^[85]エナンチオマー、^[86]環境サンプルからの多環芳香族炭化水素、 ^[87]活性酵素、^[88]およびカーボンナノチューブが含まれます。^{[89]向流クロマトグラフィーは、その高い}ダイナミックレンジのスケーラビリティで知られています。この技術を使用すると、ミリグラムからキログラム量の精製された化学成分を得ることができます。^[90]また、溶解していない粒子を含む化学的に複雑なサンプルに対応できるという利点もあります。

• クロマトグラフィーの歴史
• 超臨界流体クロマトグラフィー

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