親水性相互作用クロマトグラフィー

親水性相互作用クロマトグラフィー（または親水性相互作用液体クロマトグラフィー、HILIC）^[1]は、イオンクロマトグラフィー や逆相液体クロマトグラフィー などの他のクロマトグラフィー用途と部分的に重複する、順相液体クロマトグラフィーの変形です。HILICは、逆相タイプの溶出液で親水性固定相を使用します。この名前は、アンドリュー・アルパートがこのテーマに関する1990年の論文で提案しました。^[2] 彼は、そのクロマトグラフィー機構を、分析対象が極性が増加する順に溶出する液液分配クロマトグラフィーとして説明しました。この結論は、公開されたデータのレビューと再評価によって裏付けられています。^[3]

HILIC分離には、極性クロマトグラフィー表面であればどれでも使用できます。非極性結合シリカであっても、支持体上の結合リガンド間のシリカの露出部分により、相互作用に影響を与える可能性があるため、極めて高い有機溶媒組成で使用されています。^[4] この例外を除いて、HILIC相は、中性極性またはイオン性表面の5つのカテゴリに分類できます。^[5]

• 単純な非結合シリカシラノールまたはジオール結合相
• アミノまたはアニオン結合相^{[6] [7]}
• アミド結合相^[8]
• カチオン結合相
• 両性イオン結合相^{[9] [10]}

HILIC クロマトグラフィーの一般的な移動相には、アセトニトリル(「MeCN」または「ACN」とも呼ばれる) と少量の水が含まれます。ただし、水と混和する非プロトン性溶媒 ( THFやジオキサンなど) も使用できます。アルコールも使用できますが、非プロトン性溶媒と水の組み合わせと比較して、分析対象物の保持レベルを同程度にするには、アルコールの濃度を高くする必要があります。水性通常相クロマトグラフィーも参照してください。

HILIC では、移動相が極性固定相の表面に水分を多く含む層を形成し、水分が不足している移動相と対比して液体/液体抽出システムを形成すると一般に考えられています。分析対象物はこれら 2 つの層の間に分配されます。ただし、HILIC は単なる分割ではなく、中性極性種間の水素供与性相互作用や、保持に使用される高有機溶媒条件下での弱い静電メカニズムが含まれます。この点で、HILIC はイオン交換クロマトグラフィーとは異なるメカニズムとして区別されます。極性が高い化合物は、極性が低い化合物よりも固定水層と強く相互作用します。したがって、化合物の極性と溶媒和の程度に基づく分離が行われます。

移動相のpHとイオン強度を制御するために、通常は酢酸アンモニウムやギ酸アンモニウムなどのイオン添加剤が使用されます。HILIC では、これらの添加剤が分析物の極性にも影響し、保持に差が生じることがあります。非常に極性の強い分析物 (例: アミノグリコシド系抗生物質 (ゲンタマイシン) やアデノシン三リン酸) の場合、分析物が単一のイオン形態になるように、より高い濃度のバッファー (約 100 mM) が必要です。そうしないと、非対称なピーク形状、クロマトグラフィーのテーリング、および/または固定相からの回収率の低下が見られます。中性極性分析物 (例: 炭水化物) の分離には、バッファーは必要ありません。

100～300 mM 過塩素酸ナトリウムなどの他の塩は、高有機溶媒混合物（約 70～90%アセトニトリル）に溶解し、移動相の極性を高めて溶出に影響を与えるために使用できます。これらの塩は揮発性ではないため、この手法は質量分析計を検出器として使用する場合はあまり役に立ちません。通常、グラジエント（水の量を増やす）で溶出を促進するのに十分です。

すべてのイオンはある程度固定相に分配されるため、再現性のある固定相を確保するには、時々水で「洗浄」する必要があります。

HILIC分離モードは、極性の違いにより一部の生体分子、有機分子、および一部の無機分子を分離するために広く使用されています^[11] 。代謝プロセスでは一般に極性基が付加され、細胞組織からの除去が促進されるため、代謝物を分析する際の生物学的サンプルのサンプル調製が簡素化されたため、その有用性が高まっています。この分離技術は、グリコシル化分析^[12]や生物学的医薬品中の糖タンパク質および糖形態の品質保証にも特に適しています。^[13] クロマトグラフィー検出器としてエレクトロスプレーイオン化質量分析法を使用して極性化合物を検出する場合、有機溶媒の揮発性がはるかに高いため、HILICは逆相クロマトグラフィー^[11]よりも10倍の感度向上をもたらします。

弱イオン性の表面化学では、pH の選択がカラム化学のイオン性特性に影響を与える可能性があります。適切に調整すると、pH を設定して、カラムと同じ電荷を持つ官能基に対する選択性を低減したり、反対の電荷を持つ官能基に対する選択性を高めることができます。同様に、pH の選択は溶質の極性に影響を与えます。ただし、カラム表面化学が強イオン性で、pH スケールの中間範囲 (pH 3.5～8.5) の pH 値に耐性がある場合、これらの分離は分析物の極性のみを反映するため、メソッド開発を行う際に理解しやすくなる可能性があります。

2008 年に、アルパートは HILIC 分離に対して ERLIC ^[14] (静電反発親水性相互作用クロマトグラフィー) という造語を生み出しました。これは、イオン性カラム表面化学を利用して、分析対象物または分析対象物セット内の共通のイオン性極性基を反発させ、残りの極性基による分離を促進するものです。静電効果は、中性極性効果よりも 1 桁強い化学ポテンシャルを持っています。これにより、分析対象分子セット内の共通のイオン性基の影響を最小限に抑えたり、これらのより極性の官能基による保持の度合いを減らしたりすることができ、場合によってはグラジエントの代わりにアイソクラティック分離が可能になります。彼のその後の出版物では、配向効果^{[15]についてさらに説明しました。これは、他の人がイオン対通常相[16]}または e-HILICとも呼んでいるもので、引き合うか反発するかにかかわらず、分析対象の特定のイオン性部分に敏感な保持メカニズムを反映しています。 ERLIC (eHILIC) 分離はアイソクラティックである必要はありませんが、最終的な効果は、特に強い極性基の引力の減少です。これにより、それほど強い溶出条件は必要なくなり、分析物の残りの極性 (反対に帯電したイオン性または非イオン性) 官能基の相互作用が強化されます。アンドリュー・アルパートが発明した ERLIC カラムに基づいて、アスパラギンの脱アミド化と異性化を分離する独自の特性を持つ新しいペプチド マッピング手法が開発されました。この独自の特性は、生物製剤の品質管理における将来の質量分析法に基づく多属性モニタリングに非常に有益です。^[17]

たとえば、ERLIC 分離に陽イオン交換 (負に帯電) 表面化学を使用して、陰イオン (負に帯電) 基 (ヌクレオチドまたはホスホニル抗生物質混合物のリン酸基、または修飾炭水化物のシアリン酸基) の保持への影響を減らし、これらの分子の塩基性および/または中性官能基に基づいた分離が可能になります。表面の弱イオン基 (カルボキシルなど) の極性を変更するには、pH をその基の pKa の 2 pH 単位以内に調整することで簡単に実行できます。表面の強イオン官能基 (硫酸塩またはリン酸基) の場合は、代わりにバッファーの量を減らして、残留電荷が完全にイオン対にならないようにすることができます。一例として、12.5mM（推奨される>20mMバッファーではなく）、pH 9.2の移動相をポリマー、両性イオン、ベタインスルホン酸塩表面で使用して、ホスホニル抗生物質混合物（それぞれリン酸基を含む）を分離することが挙げられます。これにより、カラムの表面化学のスルホン酸官能基の影響が、わずかに減少した（pHによる）第四級アミンよりも強まります。これに比例して、これらの分析物は、中性極性HILIC表面を使用した場合よりも、カラムでの保持が減少し、より早く溶出し、より多くの有機溶媒で溶出します。これにより、負イオン質量分析による検出感度も向上します。

上記と同様に、選択的にリン酸化ペプチドまたは硫酸化多糖分子を分離する場合など、一連の分析対象物に対するカチオン性（正に帯電）官能基の保持への影響を軽減するために、アニオン交換（正に帯電）カラム表面化学を使用することができます。1～2 pH 単位の pH を使用すると、リン酸基の 3 つのイオン化可能な酸素のうち 2 つの極性が低下し、（反対に帯電した）表面化学から簡単に脱着できるようになります。また、分析対象物内の負に帯電したカルボキシル基の影響も軽減されます。これは、この低い pH 値でカルボキシル基がプロトン化されるため、分子の全体的な極性への寄与が小さくなるためです。一般的な正に帯電したアミノ基はカラム表面化学から反発されるため、これらの条件により、リン酸の極性（およびその他の中性極性基）の分離における役割が強化されます。