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遊離胎児 DNA ( cffDNA ) は、母体血液中を自由に循環する胎児DNA です。母体血液は静脈穿刺によって採取されます。cffDNA の分析は、高齢妊婦によく行われる非侵襲的出生前診断法です。出産後 2 時間で、cffDNA は母体血液中で検出されなくなります。
背景
cffDNAは胎盤 栄養芽細胞に由来する。[1] [2]胎盤微粒子が母体の血液循環に排出されると胎児DNAは断片化される。[3]
cffDNA断片の長さは約200塩基対（bp）で、母親のDNA断片よりも大幅に小さい。[4]この大きさの違いにより、cffDNAは母親のDNA断片と区別できる。[5] [6]
母体血液中の遊離DNAの約11～13.4%は胎児由来です。その量は妊婦ごとに大きく異なります。[7] cffDNAは妊娠5～7週後に現れます。妊娠が進むにつれてcffDNAの量は増加します。[8]母体血液中のcffDNAの量は出産後急速に減少します。出産後2時間で、母体血液中のcffDNAは検出されなくなります。[9]
cffDNAの分析により、現在の技術よりも早期に胎児の状態を診断できる可能性がある。cffDNAは母親の血液中に存在するため、採取しても自然流産のリスクはない。[10] [11] [12] [13] [14] cffDNA分析には、羊水穿刺や絨毛膜絨毛採取などの他の技術と同様の倫理的および実用的な問題がある。[15]
cffDNAを採取することの欠点としては、母体血液中のcffDNA濃度が低いこと、個人間でcffDNAの量にばらつきがあること、母体血液中のcffDNAと比較して母体細胞遊離DNAの濃度が高いことなどがあげられる。[16]
新たな証拠によると、自然妊娠と比較して体外受精妊娠ではcffDNA検査の不合格率が高く、胎児分画（母体血液サンプル中の胎児DNAと母体DNAの割合）が低く、18トリソミー、13トリソミー、SCAのPPVが減少することが示されています。[説明が必要] [17]
実験方法
細胞外胎児DNAの遺伝子欠陥スクリーニングのためのさまざまな実験方法が開発されている。主なものは（1）大規模並列ショットガンシーケンシング（MPSS）、（2）標的大規模並列シーケンシング（t-MPS）、（3）一塩基多型（SNP）に基づくアプローチである。[18] [19] [20]
妊娠10週頃に母体の末梢血サンプルを静脈切開により採取する。[21]
cffDNAの分離
実験室の遠心分離機を使用して、母体血液サンプルから血漿を分離します。その後、cffDNAを分離して精製します。[22]これを行うための標準化されたプロトコルは、科学文献の評価を通じて作成されました。cffDNA抽出の最高の収量は、「QIAamp DSPウイルスキット」で得られました。[23]
母体血液サンプルにホルムアルデヒドを添加すると、cffDNAの収量が増加します。ホルムアルデヒドは無傷の細胞を安定化させるため、母体DNAのさらなる放出を阻害します。ホルムアルデヒドを添加すると、母体血液サンプルから回収されたcffDNAの割合は0.32％から40％の間で変動し、平均は7.7％です。[24]ホルムアルデヒドを添加しない場合、回収されたcffDNAの平均割合は20.2％と測定されています。ただし、他の数値は5％から96％の間で変動します。[25] [26]
cffDNA の回収は DNA 断片の長さに関係している可能性があります。胎児 DNA を増やすもう 1 つの方法は、DNA 断片の物理的な長さに基づいています。小さな断片は、母体血液サンプル中の全細胞遊離 DNA の最大 70% を占める可能性があります。[引用が必要]
cffDNAの分析
リアルタイムPCRでは、蛍光プローブを使用してアンプリコンの蓄積を監視します。レポーター蛍光シグナルは、生成されたアンプリコンの数に比例します。最も適切なリアルタイムPCRプロトコルは、検出する特定の変異または遺伝子型に応じて設計されます。点変異は、対立遺伝子特異的プローブを使用した定性リアルタイムPCRで分析されます。挿入と欠失は、定量リアルタイムPCRを使用した用量測定によって分析されます。[引用が必要]
cffDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって父系遺伝のDNA配列を見つけることで検出される可能性がある。[27] [28]
定量的リアルタイムPCR
511人の妊娠患者のcffDNA中の性別決定Y遺伝子（SRY）とY染色体短鎖反復配列「DYS14」を定量的リアルタイムPCR（RT-qPCR）を用いて分析した。妊娠7週以上で母体血液を採取した403人中401人において、両方のDNAセグメントが検出された。[29]
ネストPCR
ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ネステッドPCR）の使用は、母親の血漿からのcffDNAのY染色体特異的シグナルを検出することで性別を判定するために評価されました。ネステッドPCRは55人の男児のうち53人を検出しました。女児を持つ25人の女性のうち3人の血漿からのcffDNAには、Y染色体特異的シグナルが含まれていました。この実験でのネステッドPCRの感度は96パーセントでした。特異度は88パーセントでした。[30]
デジタルPCR
マイクロ流体デバイスは、リアルタイムPCRを超える精度で母体血漿中のcffDNAセグメントの定量化を可能にします。点突然変異、ヘテロ接合性の喪失、異数性を1回のPCRステップで検出できます。[31] [32] [33]デジタルPCRは、母体血漿と胎児DNAを多重的に区別することができます。[31]
ショットガンシーケンス
Solexa や Illumina などのツールを使用した高スループットショットガン シーケンシングでは、母体血清のサンプル 1 つあたり約 500 万のシーケンス タグが生成されます。妊娠 14 週目に検査を行ったところ、トリソミーなどの異数性妊娠が特定されました。親のハプロタイプ分析による胎児の全ゲノム マッピングは、母体血清からの cffDNA のシーケンシングを使用して完了しました。[13]妊娠した女性は、2 プレックスの大規模並列母体血漿 DNA シーケンシングを使用して調査され、Z スコアが 3 を超えるとトリソミーと診断されました。 [34]シーケンシングでは、感度 100 パーセント、特異度 97.9 パーセント、陽性予測値96.6 パーセント、陰性予測値100 パーセントが得られました。[要出典]
質量分析
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）とPCR後の一塩基伸長法を組み合わせることで、一塩基特異性と一DNA分子感度でcffDNAを検出できます。 [35] DNAはPCRで増幅されます。次に、塩基伸長反応（第3のプライマーを使用）による線形増幅が、変異部位の上流領域にアニールするように設計されます。1つまたは2つの塩基が伸長プライマーに追加され、野生型DNAと変異DNAから2つの伸長産物が生成されます。一塩基特異性は、 TaqMan加水分解プローブを使用したハイブリダイゼーションベースの技術よりも優れています。この技術を評価したとき、16の母体血漿サンプルで胎児の性別を決定するためにcffDNAを探したときに、偽陽性または偽陰性は見つかりませんでした。[35] MALDI-TOF質量分析法を使用して、91人の男性胎児の性別が正しく検出されました。この技術の精度、感度、特異性は99％以上でした。[36]
エピジェネティックな修飾
母体DNAと胎児DNAの遺伝子活性化の違いを利用することができる。エピジェネティック修飾（DNA配列を変えずに遺伝子機能を変える遺伝性修飾）はcffDNAの検出に使用できる。[37] [38]過剰メチル化 RASSF1 Aプロモーターは、cffDNAの存在を確認するために使用される普遍的な胎児マーカーである。[39]母体血漿からcffDNAを抽出し、メチル化感受性および非感受性制限酵素で消化する技術が説明されている。次に、RASSF1A、SRY、およびDYS14のリアルタイムPCR分析を行った。[39]この手順により、過剰メチル化RASSF1Aが存在する母体血液サンプル90個中79個（88％）が検出されました。[要出典]
mRNA
胎盤で発現した遺伝子からのmRNA転写産物は、母体血漿で検出できる。[40]この手順では、血漿を遠心分離して水層を出現させる。この層を移し、そこからRNAを抽出する。RT -PCRは、選択されたRNA発現を検出するために使用される。例えば、ヒト胎盤ラクトゲン（hPL）およびβ-hCG mRNAは母体血漿中で安定しており、検出可能である。（Ng et al. 2002）。これは、母体血漿中のcffDNAの存在を確認するのに役立つ可能性がある。[16]
アプリケーション
出生前の性別判定
母親の血漿サンプルから cffDNA を分析することで、出生前性別判別が可能になります。出生前性別判別の用途には以下のものがあります。
- 疾患検査：胎児の性別が男か女かによって、特定の妊娠における特定のX連鎖劣性遺伝疾患のリスクを判定することが可能となり、特に母親がその疾患の遺伝的保因者である場合にそのリスクが判定される。[41]
- 子育てにおける性別に依存するあらゆる側面に対する準備。 [要出典]
- 性別選択は、着床前遺伝子診断後に希望する性別の胚のみを選択することによって行われる場合もあれば、着床後の方法の後に検査結果と個人の好みに応じて性別選択的中絶を行うことによって行われる場合もあります。
妊娠初期の性別判定に信頼性の低い産科超音波検査や流産のリスクがわずかにある羊水穿刺と比較すると、cffDNAの分析のために母体血漿を採取することはリスクがない。[42] cffDNA分析の主なターゲットは、Y染色体上の性別決定領域Yタンパク質（SRY）の原因遺伝子とDYS14配列である。[43] [44]
先天性副腎過形成
先天性副腎過形成では、副腎皮質が適切なコルチコステロイドの合成を欠いているため、副腎アンドロゲンが過剰になり、女性胎児に影響を及ぼします。[45]女性胎児の性器は外部男性化します。[46]リスクのある胎児の母親には、妊娠6週目にデキサメタゾンが投与され、下垂体からのアンドロゲンの放出が抑制されます。[47]
母親の血漿サンプルから得られた cffDNA の分析で Y 染色体上にのみ見られる遺伝子マーカーが欠落している場合、胎児が女性であることが示唆されます。ただし、分析自体が失敗したことを示している可能性もあります (偽陰性の結果)。父親の遺伝子多型と性別に依存しないマーカーは cffDNA の検出に使用できます。この用途では、これらのマーカーの高度なヘテロ接合性が必要です。[48]
父子鑑定
出生前DNA親子鑑定は市販されており、妊娠9週目から実施できる。[要出典]
単一遺伝子疾患
父系DNAの分析によって出生前診断されている常染色体優性および劣性単一遺伝子疾患には、嚢胞性線維症、βサラセミア、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、および筋強直性ジストロフィーなどがある。[27] [43]常染色体劣性変異、母系遺伝の常染色体優性変異、またはDNA配列の重複、拡張、または挿入を含む大配列変異による単一遺伝子疾患の出生前診断はより困難である。[49]
cffDNAでは、単一遺伝子疾患に関与する200～300bpの長さの断片を検出することはより困難です。[要出典]
例えば、常染色体優性疾患である軟骨無形成症は、 FGFR3遺伝子の点変異によって引き起こされます。[50]軟骨無形成症の胎児を持つ2人の妊娠において、1人では母親の血漿サンプルのcffDNAから父系遺伝のG1138A変異が見つかり、もう1人ではG1138Aの新生突然変異が見つかりました。[50]
母親の血漿サンプルからのcffDNAのqRT-PCRを用いたハンチントン舞踏病の遺伝学研究では、 CAGリピートが正常レベル（17、20、24）で検出された。[51]
cffDNAは単一遺伝子疾患の診断にも使用できる。[15] cffDNAを用いた実験プロセスの発達により、胎児のトリソミー21 （ダウン症候群）などの異数性の出生前診断が可能になる可能性がある。 [52] [32]
胎児および新生児の溶血性疾患
胎児と母親のRhD抗原の不適合が新生児溶血性疾患の主な原因である。[53]白人女性の約15％、黒人アフリカ人女性の3～5％、アジア人女性の3％未満がRhD陰性である。[54]
この病気は新生児にとって致命的となる可能性があり、リスクのある母親には筋肉内免疫グロブリン（抗D）または静脈内免疫グロブリンなどの治療を施すことができるため、正確な出生前診断が重要である。[55]
妊娠9週から13週の間に母親の血漿から採取したcffDNAからRHD（遺伝子）遺伝子エクソン5と7を検出するPCRは、新生児臍帯血血清からのRhD判定と比較して、高い特異性、感度、診断精度（> 90パーセント）を示します。[53]エクソン7と10をターゲットにしても同様の結果が得られました。 [56]胎児RhD判定におけるドロップレットデジタルPCRは、通常のリアルタイムPCR技術に匹敵しました。[57]
母体血清中のcffDNAから胎児のRhD状態を定期的に判定することで、リスクのある妊娠の早期管理が可能になり、抗Dの不必要な使用が25％以上減少します。[58]
異数性
- 性染色体
ハイスループットシーケンシングによる母体血清cffDNAの分析では、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、トリプルX症候群などの一般的な胎児性染色体異数性を検出することができますが、この手順の陽性予測値は低いです。[59]
- 21トリソミー
ダウン症候群の原因は、胎児の21番染色体のトリソミーです。このトリソミーは、母体血液のcffDNAを超並列ショットガンシークエンシング（MPSS）で分析することで検出できます。[61]別の技術は、選択領域のデジタル分析（DANSR）です。[61]このような検査は、約99％の感度と99.9％を超える特異度を示しています。したがって、これらは診断手順とは見なされませんが、妊娠第1期スクリーニングや疾患の超音波マーカーなどの母親のスクリーニング検査が陽性であることを確認するために使用される場合があります。[61] [62]
- 13トリソミーおよび18トリソミー
MPSSの母体血漿からcffDNAを解析して13トリソミーまたは18トリソミーを探すことは可能である[63]
感度と特異度を制限する要因としては、母体血漿中のcffDNAのレベルや母体染色体のモザイクの可能性などが挙げられます。[64]
異数性染色体に由来する胎児核酸分子の多くは、SERPINEB2 mRNA、clad B、18番染色体の低メチル化SERPINB5、胎盤特異的4（PLAC4）、高メチル化ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）、および12番染色体のc21orf105 mRNAを含めて検出できます。 [65]完全トリソミーの場合、母体血漿中のmRNA対立遺伝子は通常の1：1の比率ではなく、実際には2：1です。エピジェネティックマーカーによって決定される対立遺伝子比を使用して、完全トリソミーを検出することもできます。胎児異数性検出のための大規模並列シーケンシングとデジタルPCRは、胎児特異的核酸分子に制限されることなく使用できます。 (MPSS) は、ダウン症候群の検出に対して96〜100％の感度と94〜100％の特異度を持つと推定されています。妊娠10週から実施できる。[66]米国のある研究では、ダウン症候群の検出にcffDNAを使用した場合、偽陽性率は0.3％、陽性予測値は80％と推定された。 [67]
妊娠中毒症
子癇前症は、妊娠20週以降に高血圧とタンパク尿を伴う複雑な妊娠病態である。 [68]子宮筋層への細胞栄養芽細胞の浸潤不良と関連している。妊娠20週から34週の間に発症すると「早期」とみなされる。[69]子癇前症を合併した妊娠の母体血漿サンプルは、正常妊娠の母体血漿サンプルよりもcffDNAのレベルが著しく高い。[70] [71] [72]これは早期発症の子癇前症にも当てはまる。[69]
歴史
1997年、香港の分子生物学者デニス・ローと彼のチームは、初めてY-PCR法を用いて、母親の血漿サンプル中の胎児Y染色体配列（Y染色体特異的配列は母親のゲノムには存在しない胎児の遺伝子配列であるため[73]）を特定しました。[74]この画期的な研究により、ローは2022年のラスカー・デバキー臨床医学研究賞を受賞しました。[75]
将来の展望
新世代シーケンシングはcffDNAから全ゲノム配列を得るために使用される可能性がある。これは倫理的な問題を提起する。[76]しかし、特定の遺伝子変異と疾患状態との明確な関連性が発見されるにつれて、この手法の有用性は高まる可能性がある。[77] [78]
参照
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