幹細胞分化におけるエピジェネティクス

胚性幹細胞は、体内の位置に応じて自己複製し、目的の運命へと分化する能力を持つ。幹細胞の恒常性は、クロマチン構造や特定の遺伝子転写プログラムを制御する非常に動的なエピジェネティック機構によって維持されている。^{[ 1 ]}エピジェネティクスは、 DNA配列に影響を与えない修飾によって遺伝する遺伝子発現の変化を指すために用いられてきた。 ^{[ 2 ]}

哺乳類のゲノムエピゲノムは、幹細胞の初期発生中に全体的なリモデリングを受け、細胞が目的の系統に限定されるように決定づけられる必要がある。幹細胞の系統決定の維持は、DNAメチル化、ヒストン修飾、 ATP依存性クロマチン構造のリモデリングの調節などのエピジェネティック機構によって制御されていることを示唆する複数の証拠がある。^{[ 1 ] [ 3 ]}ヒストンコード仮説に基づくと、異なる共有結合ヒストン修飾は、細胞の運命に影響を与える機能的に異なるクロマチン構造につながる可能性がある。

エピジェネティック修飾によるクロマチンの制御は、細胞が望ましい運命へと分化を続けるかどうかを決定する分子メカニズムである。Leeらによる研究では、マウス胚性幹細胞（ES細胞）のin vitro分化を通して、エピジェネティック修飾がクロマチン構造に及ぼす影響と、幹細胞分化中のこれらのエピジェネティックマーカーの調節について検討した。^{[ 4 ]}

胚性幹細胞は、全体的および部位特異的なクロマチン構造の両方において、劇的かつ複雑な変化を示す。Leeらは、ヒストン部位H3K9およびH3K4の特定の部位特異的修飾における全体的なアセチル化およびメチル化レベルを調べることにより、幹細胞分化における脱アセチル化およびアセチル化の重要性を決定する実験を行った。エピジェネティック修飾によって制御されるこれらのヒストンにおける遺伝子発現は、胚性幹細胞を目的の細胞系統に限定し、細胞記憶を発達させる上で重要である。

哺乳類細胞では、シトシンメチル化の維持はDNAメチルトランスフェラーゼによって触媒され、これらのメチルトランスフェラーゼに何らかの障害が生じると、胚に致死的な表現型が生じます。シトシンメチル化は、不活性ヘテロクロマチンに関連し、主にCpGジヌクレオチドで起こるH3K9で調べられ、一方、全体的なアセチル化は、活性ユークロマチンに関連し、H3K4で調べられます。哺乳類の接合子ゲノムは、受精後に能動的および受動的な全体的なシトシン脱メチル化を受け、胚盤胞段階でCpGメチル化が20%の最小値に達し、その後、クロマチン構造を再プログラムして全体的なCpGメチル化レベルを60%まで回復させるメチル化の波が続きます。^{[ 4 ]}メチル化レベルが低下したり上昇したりした胚性幹細胞は生存可能だが分化できないため、哺乳類の発生にはシトシンメチル化の重要な制御が必要である。

体外胚性幹細胞の分化開始後、さまざまな時間間隔（6日間）でクロマチン中のヒストン修飾を分析した。白血病抑制因子（LIF）の除去が分化を誘発する。LIF除去後の特定部位におけるヒストン修飾の代表的なデータは、ウェスタンブロッティングを用いて評価され、1日後にはヒストンH3のH3K4およびH3K9位置で強い脱アセチル化が起こり、2日目までにアセチル化がわずかに増加することが確認された。

ヒストンH3K4のメチル化もLIF除去後1日で減少したが、分化2～4日目に回復し、最終的に5日目には再び減少した。これらの結果は、胚性幹細胞の分化開始時に活性ユークロマチンエピジェネティックマークのレベルが低下し、その後すぐにエピゲノムの再プログラミングが起こることを示している。

H3K9位置のヒストン修飾は、未分化胚性幹細胞のジメチル化およびトリメチル化の減少を示し、6日間のin vitro分化の過程でメチル化が徐々に増加した。これは、このヒストンマークにおける不活性ヘテロクロマチンレベルの全体的な増加を示している。

胚性幹細胞が分化するにつれて、活性ユークロマチンのマーカー（ヒストンアセチル化およびH3K4メチル化）はLIF除去後に減少しており、細胞が実際に分化が進んでいることを示している。これらのマーカーがわずかに回復することで、マーカーを再び減少させる機会が与えられ、細胞が成熟状態に近づくことで、さらなる分化が起こる。活性ヘテロクロマチンのマーカーであるH3K9meも6日間を通して増加していることから、分化が起こると、細胞が目的の運命へと分化するにつれてヘテロクロマチンが形成され、細胞が不活性化されてそれ以上の分化が阻止されると結論付けられる。

哺乳類では、DNAメチル化は多能性の重要な要素である急速な自己複製能力の調節に役割を果たしている。Khavariらは、DNAメチル化の基本的なメカニズムと、分化を調節するいくつかの経路との相互作用について議論した。 ^{[ 5 ]}さまざまな分化状態におけるDNAメチル化のゲノム状態を研究する新しいアプローチでは、推定エンハンサーに関連するCpG部位のメチル化がこのプロセスにおいて重要であることが示されている。DNAメチル化は、メチル化CpGジヌクレオチドを含む配列に結合特異性を示すMeCP2などのリプレッサーをリクルートすることにより、転写因子の結合親和性を調節することができる。DNAメチル化は、それぞれ異なる機能を果たす特定のメチルトランスフェラーゼDMNTによって制御されている。 DNMT3AとDNMT3Bはともに幹細胞の初期発生におけるDNAメチル化パターンの確立に関与していることが示唆されている一方、DNMT1は細胞が複製を終えた後に新たに合成されたDNA鎖をメチル化し、エピジェネティックな制御状態を維持するために必要である。多くのタンパク質がDNMT自体と物理的に相互作用し、 DNMT1をヘミメチル化DNAに標的化するのを助ける。

いくつかの新しい研究は、未分化状態を維持するために、 DNAメチル化が細胞周期の調節やDNA修復経路と相互作用する中心的な役割を担っていることを示唆している。胚性幹細胞では、未分化前駆細胞区画におけるDNMT1の欠乏は、細胞周期の停止、早期分化、および組織の自己再生の失敗につながった。DNMT1の喪失は、分化遺伝子の活性化と細胞周期の進行を促進する遺伝子の喪失に伴う深刻な影響によって生じたため、DNMT1や他のDNMTは分化を継続的に抑制して多能性状態を維持しているわけではないことが示唆される。

これらの研究は、さらなる分化とヘテロクロマチンの形成を可能にする幹細胞状態を維持するために、DNMTの相互作用が重要であることを示唆している。

岡本らは以前、胚性幹細胞の分化に伴ってOct4遺伝子の発現レベルが低下することを報告した。 ^{[ 6 ]} Lee らは、未分化細胞に関連する Oct4 プロモーター領域のChIP解析を行い、胚性幹細胞の分化中に発生する制御遺伝子のエピジェネティック修飾を調べた。このプロモーター領域では、分化中にH3K4メチル化部位とH3K9アセチル化部位が減少し、H3K9メチル化部位が増加した。Oct4遺伝子プロモーターの CpG モチーフの解析では、DNA メチル化が徐々に増加し、Gidekel と Bergman が以前に報告したように、分化 10 日目には完全にメチル化されることが明らかになった。^{[ 7 ]}

これらの結果は、H3K4のアセチル化の減少とH3K9meの増加により、活性ユークロマチンから不活性ヘテロクロマチンへの移行が起こったことを示している。これは、Oct4遺伝子において細胞が分化していることを意味し、Oct4遺伝子発現の抑制と一致する。

ヒストン修飾について試験された別の部位特異的遺伝子は、中胚葉分化のマーカーであり、未分化胚性幹細胞ではわずかにしか発現しないBrachyury遺伝子であった。「Brachyury」は分化5日目に誘導され、分化最終日である10日目までに完全にサイレンシングされた。 ^{[ 8 ]} 「Brachyury」遺伝子プロモーターのChIP解析により、胚性幹細胞分化の0日目と5日目にH3K4のモノメチル化とジメチル化の発現が増加し、10日目には遺伝子発現が消失することが明らかになった。H3K4トリメチル化は、Brachyury遺伝子発現が最も高かった時期と一致しており、5日目にのみ遺伝子発現があった。すべての形態のH3K4メチル化は分化10日目には消失しており、これはBrachyury遺伝子発現のサイレンシングと相関している。両方のヒストンのモノメチル化は0日目に発現を生じ、クロマチン構造には役立たないマーカーであることを示している。 H3K9のアセチル化は、分化誘導時に下方制御されるため、Brachyury遺伝子発現とは相関しない。DNAメチル化発現を調べたところ、サザンブロット解析で中間サイズのbadが形成されなかったことから、プロモーター領域の上流にあるCpGモチーフは、この部位のシトシンメチル化がない場合、メチル化されないことが示唆された。

これらの研究から、H3K9ジメチル化とトリメチル化の両方がDNAメチル化と遺伝子発現と相関し、H3K4トリメチル化はBrachyury遺伝子の最高遺伝子発現段階と関連していることが実証されている。Santos-Rosaによる以前の報告は、酵母において活性遺伝子がH3K4トリメチル化と関連していることを示しており、これらのデータと一致している。^{[ 9 ]}

このデータは、 Oct4遺伝子の場合と同じ結果を示しており、分化が起こるとヘテロクロマチンが形成され、同時にBrachyury遺伝子の発現が抑制されることが再び確認された。

Mierlo らによる研究では、H3K27me3とPCR2ポリコーム抑制複合体の独自のパターンが、ES 細胞が基底状態から抜け出したり、プライム状態に入ったりするのを防いでいることを示唆するデータが得られました。 ^{[ 10 ]} 彼らは、基底状態の ESC が LIF または 2i によって維持されているという観察から始め、基底状態のエピゲノムがどのようなものかを調べ始めました。ChIP-seq プロファイリングを使用して、H3K27me3 のベースラインレベルが、血清 (プライム状態) の ESC と比較して 2i ESC で高いことを決定できました。この結論は、同じ論文で、H3K27me3 を無用にする機能的な PRC2 複合体を除去すると 2i ESC がプライムのような性質を獲得するという発見によってさらに裏付けられました。^{[ 10 ]}

白血病抑制因子（LIF）はすべての細胞株から除去された。LIFは細胞分化を阻害し、その除去により細胞株は細胞分化を経ることができる。細胞株は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）で6日間処理された。細胞株の1つのグループは10nMのTSAで処理された。ウェスタンブロット解析では、胚性幹細胞分化のコントロールで観察された1日目の初期脱アセチル化の欠如が示された。ヒストン脱アセチル化酵素活性の欠如により、 H3K9とヒストンH4のアセチル化が可能になった。胚性幹細胞は、細胞分化の指標の1つとして胚様体形成を観察するために形態学的にも分析された。10nM TSAで処理した細胞は、コントロール細胞株で観察されたように、6日目までに胚様体を形成しなかった。これは、TSAで処理したES細胞は1日目に脱アセチル化を欠いており、LIFの除去後に分化しなかったことを示唆している。第2群「-TSA Day4」はTSAで3日間処理した。TSA処理を中止すると、4日目に脱アセチル化が観察され、5日目にはアセチル化が回復した。形態学的検査では、6日目までに胚様体の形成が認められた。さらに、胚様体の形成は対照細胞株よりも速かった。これは、「-TSA Day4」株はLIFの除去に反応していたが、分化表現型を獲得できなかったことを示唆している。TSA処理の中止後、急速に分化表現型を獲得することができた。第3群「5 nM TSA」の形態学的検査では、対照群と10 nM-TSA群の中間の効果が認められた。低用量のTSAでは、胚様体の形成が認められた。この実験は、TSAがヒストン脱アセチル化酵素を阻害し、ヒストン脱アセチル化酵素の活性が胚性幹細胞の分化に必要であることを示している。 1日目の初期脱アセチル化がなければ、ES細胞は分化過程を経ることができない。

ヒトに見られるアルカリホスファターゼは膜結合型糖タンパク質であり、一リン酸エステルの加水分解を触媒する機能を持つ。McKennaら（1979）は、少なくとも3種類のアルカリホスファターゼ（腎臓、肝臓、骨のアルカリホスファターゼ）が存在し、これらはすべて同じ構造遺伝子によってコードされているが、糖鎖部分は同一ではないことを発見した。したがって、アルカリホスファターゼの種類によって、タンパク質の翻訳後糖鎖修飾における酵素的プロセスにおいて独自の構成要素が発現する。^{[ 11 ]}

通常の幹細胞では、アルカリホスファターゼ活性は分化に伴って低下します。トリコスタチンAは、細胞がアルカリホスファターゼ活性を維持するように作用します。トリコスタチンAは、哺乳類のヒストン脱アセチル化酵素を可逆的に阻害し、細胞増殖の阻害につながります。トリコスタチンAを3日後に除去すると、アルカリホスファターゼの消失が著しく増加することが観察されました。アルカリホスファターゼ活性は形態変化と相関しています。ヒストンの初期脱アセチル化は、胚性幹細胞の分化に必要です。^{[ 12 ]}

Dovery ら (2010) は、HDACノックアウト マウスを用いて、 HDAC1またはHDAC2 が胚性幹細胞の分化に重要である かどうかを実証した。HDAC 1 が存在しない状態での全体的なヒストン アセチル化の調査では、アセチル化の増加が示された。全体的なヒストン アセチル化レベルは、HDAC2 の欠損によって変化しなかった。HDAC ノックアウト マウスのプロセスを詳細に分析するために、ノックアウト マウスの胚性幹細胞を用いて胚様体を生成した。その結果、原腸形成の直前または最中に、HDAC1 を欠損した胚性幹細胞が目に見える発生異常を獲得することが示された。HDAC1 ノックアウト胚性幹細胞の培養を継続すると、形成された胚様体は、正常マウスのように均一な球形ではなく、不規則でサイズが小さくなることが示された。胚性幹細胞の増殖はHDAC1またはHDAC2のいずれかの欠損によって影響を受けなかったが、胚性幹細胞の分化はHDAC1の欠損によって影響を受けた。これは、HDAC1が分化中の細胞運命決定に必要であることを示している。^{[ 13 ]}

Chronisら（2017）の研究では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングする過程で、OSK（山中因子4つのうちの3つ、Oct4、Sox2、KLF4、c-Myc）が他の転写因子と協働してエンハンサーランドスケープを変化させ、分化の喪失と多能性の獲得につながることが明らかになった。彼らは、リプログラミング段階におけるOSKM結合クロマチン状態をマッピングし、機能喪失および機能獲得実験を行うことで、これを明らかにした。また、OSKがHdac1を介してME（MEFエンハンサー）を部分的にサイレンシングしていることも明らかにし、Hdac1が体細胞のリプログラミング過程において役割を果たしていることを示唆した。^{[ 14 ]}

エピジェネティクスは、分化の遺伝子発現の調節において重要であることが知られています。そのため、分化中にエピジェネティック機構を阻害する低分子化合物や薬剤に関する研究は、間葉系幹細胞からの骨再生などの臨床応用において大きな可能性を秘めています。^{[ 15 ]}このような応用例の1つは、メラノーマの状況下でDNAメチルトランスフェラーゼ1（DNMT1）を枯渇させるためにデシタビン（デオキシシチジンアナログ）を使用することです。^{[ 16 ]} Alcazarらは、DNMT1枯渇の結果として遺伝子発現の変化を引き起こし、メラノサイトの分化を促し、腫瘍の増殖を抑制することを目的としてこれを行いました。このような低分子化合物（エピドラッグ）は、治療用途において大きな可能性を秘めている一方で、リスクも伴います。DNMT阻害剤（デシタビン）に戻ると、貧血などの既知の副作用に加え、その他の予期せぬオフターゲット効果が発生する可能性があります。^{[ 15 ]}これは、エピドラッグ標的の特異性を向上させること、および新しい改良された薬物送達方法を考案することの重要性を強調している。^{[ 15 ]}

C. ワディントンは、「エピジェ​​ネティックランドスケープ」というメタファーを考案しました。これは、ビー玉が地形に沿って転がり、その進路が地形によって決まり、最終的に低い地点に向かっていくというものです。さまざまな地点で、これらの経路は分岐し、ビー玉は1つの経路を進みます。このメタファーでは、ビー玉は発生中の細胞であり、このメタファーは細胞分化の根底にある遺伝子制御のダイナミクス（エピジェネティクス）に拡張できます。^{[ 17 ]} Wang ら（2011）は、これに関する理論的/数学的フレームワークを開発しました。これは、ワディントンランドスケープのアイデアをデータ駆動型の方法で遺伝子制御ネットワークにリンクする最初の試みの1つであるため重要です。彼ら自身の言葉によれば、これは「多能性細胞が2つの細胞運命の1つに二者択一の運命決定とコミットメントを行う全体的な性質を研究するためのフレームワーク」を提供し、細胞の再プログラミングや、分化を促進する可能性のあるものについてより深く学ぶための非常に貴重なツールになり得ます。

DNAメチル化によって媒介される安定したエピジェネティックな遺伝子発現制御のあらゆる障害は、癌を含む多くのヒト疾患と関連しており、偽性副甲状腺機能低下症IA型、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、アンジェルマン症候群などの先天性疾患も含まれる。これらの疾患はそれぞれ、特定の遺伝子座におけるメチル化に基づくインプリンティングの変化によって引き起こされる。

シトシンメチル化の全体的および遺伝子特異的なパターンの両方の乱れは癌でよく観察される一方、ヒストン脱アセチル化は減数分裂中の卵母細胞における核の再プログラミングの重要な特徴である。^{[ 18 ]}

近年の研究により、DNAメチル化による適切なエピジェネティック制御を実現するために、互いに協力し合う様々な経路が存在することが明らかになった。表皮やその他の組織の体性幹細胞において、 DNA結合タンパク質、DNA修復、非コードRNAなどの特定のメカニズム経路が、DNAメチル化を制御して分化を抑制し、自己複製を維持する役割をさらに明確にするためには、今後の研究が必要となるだろう。これらの疑問に取り組むことで、胚性幹細胞の分化制御におけるDNAメチル化のエピジェネティック制御因子の中心的な役割に関する最近の知見への理解を深めることができるだろう。^{[ 5 ]}