クロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降法（ChIP ）は、細胞内のタンパク質とDNAの相互作用を調べるために用いられる免疫沈降実験手法の一種です。この手法は、特定のタンパク質がプロモーター上の転写因子やその他のDNA結合部位などの特定のゲノム領域と関連しているかどうかを判断し、シストロームを定義することを目的としています。ChIPはまた、様々なヒストン修飾がゲノム内のどの特定の場所と関連しているかを判断し、ヒストン修飾因子の標的を示すことも目的としています。^{[ 1 ]} ChIPは、エピゲノミクス分野の進歩とエピジェネティック現象の理解を深める上で非常に重要です。^{[ 2 ]}

簡単に言うと、従来の方法は次のとおりです。

1. 生細胞または組織のクロマチン上のDNAおよび関連タンパク質は架橋される（このステップはネイティブChIPでは省略される）。
2. DNA-タンパク質複合体（クロマチン-タンパク質複合体）は、超音波処理またはヌクレアーゼ消化 によって約500bpのDNA断片に切断される。
3. 目的のタンパク質と結合した架橋DNA断片は、適切なタンパク質特異的抗体を用いて細胞破片から選択的に免疫沈降される。
4. 関連するDNA断片を精製し、その配列を決定する。特定のDNA配列が濃縮されることは、目的のタンパク質が生体内で結合しているゲノム上の領域を示す。

ChIPには主に2種類あり、主な違いは出発原料となるクロマチンの調製方法にある。1つ目は、超音波処理によって可逆的に架橋されたクロマチンを用いるもので、クロスリンクChIP（XChIP）と呼ばれる。ネイティブChIP（NChIP）は、ミクロコッカスヌクレアーゼ消化によって切断された天然クロマチンを用いる。

ChIP-seqとChIP-chipの比較

クロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-seqとも呼ばれる）は、ゲノム全体にわたる転写因子結合イベントを特定するために使用される実験技術です。ヒトの体内のタンパク質がDNAとどのように相互作用して遺伝子発現を制御するのかを知ることは、ヒトの疾患や生物学的プロセスに関する知識の重要な要素です。ChIP -seqは、タンパク質と転写因子が表現型メカニズムにどのように影響するかを解明するのに非常に効果的であることが証明されているため、このタスクを完了するための主要な技術です。全体として、ChIP-seqはこれらの因子を決定するための非常に効率的な方法となっていますが、ChIP-on-chipと呼ばれる競合する方法があります。

ChIP-on-chip（ ChIP-chipとも呼ばれる）は、生細胞内で特定のDNA結合タンパク質が占めるゲノム部位を分離・同定するために用いられる実験手法です。ChIP-on-chipは比較的新しい技術で、2001年にペギー・ファーナムとマイケル・チャンによって導入されました。ChIP-on-chipという名称は、クロマチン免疫沈降法とDNAマイクロアレイ法を組み合わせたことに由来します。

2 つの方法は、ヒトゲノム内の要素を特定するのに役立つタンパク質結合部位を見つけようとするため、同様の結果を目指しています。ヒトゲノム内のこれらの要素は、ヒトの疾患や生物学的プロセスに関する知識の進歩にとって重要です。ChIP-seq と ChIP-chip の違いは、タンパク質結合部位の特定によって決まります。主な違いは、2 つの技術の有効性にあります。ChIP-seq は、ゲノムの広範囲をカバーするため、より高い感度と空間分解能の結果が得られます。ChIP-seq は ChIP-chip よりも効率的であることが証明されていますが、ChIP-seq が常に科学者の第一の選択肢になるとは限りません。ChIP-seq のコストとアクセスの容易さは大きな欠点であり、世界中の研究室で ChIP-chip がより多く使用される原因となっています。^{[ 2 ]}

表1 NChIPとXChIPの利点と欠点

1984年、ジョン・T・リスと、当時リス研究室の大学院生であったデビッド・ギルモアは、紫外線照射、ゼロ長タンパク質-核酸架橋剤を用いて、生きた細菌細胞内のDNAに結合したタンパク質を共有結合的に架橋した。架橋された細胞を溶解し、細菌RNAポリメラーゼを免疫沈降させた後、濃縮されたRNAポリメラーゼに関連するDNAを、既知の遺伝子の異なる領域に対応するプローブとハイブリダイズさせて、これらの遺伝子におけるRNAポリメラーゼの生体内分布と密度を決定した。1年後、彼らは同じ方法論を用いて、ショウジョウバエの熱ショック遺伝子上の真核生物RNAポリメラーゼIIの分布を研究した。これらの報告は、クロマチン免疫沈降の分野における先駆的な研究と考えられている。^{[ 9 ] [ 10 ]} XChIPは、ホルムアルデヒド架橋を用いて熱ショック遺伝子上のヒストンH4の分布を調べたアレクサンダー・ヴァルシャフスキーらによってさらに改良・開発された。 ^{[ 11 ] [ 12 ]}この技術はその後、広範囲に開発され、改良されました。^{[ 13 ]} NChIP アプローチは、1988 年に Hebbesら によって初めて記述され、^{[ 14 ]}急速に開発され、改良されました。^{[ 15 ]}通常の ChIP アッセイは通常 4 ～ 5 日かかり、少なくとも 10 ⁶～ 10 ⁷個の細胞が必要です。現在では、ChIP に関する新しい技術により、わずか 100 ～ 1000 個の細胞で、1 日で完了できるようになりました。

• ビーズフリーChIP：この新しいChIP法では、スピンカラムまたはマイクロプレート内で、プロテインAまたはGで機能化された不活性な多孔質ポリマーのディスクを使用します。クロマチン抗体複合体はディスクに選択的に保持され、溶出されてqPCRやシーケンスなどの下流アプリケーション用の濃縮DNAが得られます。多孔質環境は、捕捉効率を最大化し、非特異的結合を減らすように特別に設計されています。手作業が少なく、プロトコルが最適化されているため、ChIPは5時間で実行できます。^{[ 7 ]}
• キャリアChIP （CChIP）：このアプローチでは、ショウジョウバエ細胞をキャリアクロマチンとして加えることで、損失を減らし、標的クロマチンの沈殿を促進するため、わずか100個の細胞で済む可能性があります。ただし、異種キャリアクロマチンの背景から標的細胞クロマチンを検出するために非常に特異的なプライマーが必要であり、2～3日かかります。^{[ 16 ]}
• 高速ChIP（qChIP）：高速ChIPアッセイは、通常のChIPアッセイの2つのステップを短縮することで時間を短縮しました。（i）超音波浴により抗体の標的タンパク質への結合速度が加速され、免疫沈降時間が短縮されます。（ii）樹脂ベース（Chelex-100）のDNA分離手順により、架橋解除とDNA分離の時間が短縮されます。ただし、高速プロトコルは、大きな細胞サンプル（10 ⁶～ 10 ⁷の範囲）にのみ適しています。^{[ 17 ] [ 18 ]} 最大24個の断片化クロマチンサンプルを処理して5時間でPCR準備済みのDNAを得ることができ、複数のクロマチン因子を同時にプローブしたり、複数の時点にわたるゲノムイベントを調べたりすることができます。^{[ 19 ]}

• 迅速定量ChIP（Q2ChIP ^）：このアッセイは、100,000個の細胞を出発材料として使用し、最大1,000個のヒストンChIPまたは100個の転写因子ChIPに適しています。したがって、多くのクロマチンサンプルを並行して準備して保存することができ、Q2ChIP^は1日で実施できます。^{[ 20 ]}
• MicroChIP (μChIP): クロマチンは通常 1,000 個の細胞から調製され、キャリアなしで最大 8 個の ChIP を並行して実行できます。アッセイは 100 個の細胞から開始することもできますが、1 つの ChIP にのみ適しています。小さな (1  mm ³ ) 組織生検を使用することもできます。マイクロ ChIP は 1 日で実行できます。^{[ 21 ] [ 22 ]}
• マトリックスChIP：これは、スループットが向上し、手順が簡素化されたマイクロプレートベースのChIPアッセイです。すべてのステップはサンプル移送なしでマイクロプレートのウェルで行われるため、自動化の可能性が広がります。1日でヒストンとさまざまなDNA結合タンパク質の96個のChIPアッセイが可能です。^{[ 23 ]}
• 病理学ChIP（PAT-ChIP）：この技術は、病理学ホルマリン固定パラフィン包埋組織からのChIPを可能にし、病理学アーカイブ（数年前のものでも）をエピジェネティック解析や候補エピジェネティックバイオマーカーまたはターゲットの同定に利用することを可能にする。^{[ 24 ]}

ChIPは、マイクロアレイ技術（ ChIP-on-chip）または第2世代DNAシーケンシング技術（Chip-Sequencing）と組み合わせることで、ゲノムワイド解析にも応用されています。ChIPは、ペアエンドタグシーケンシングを用いたクロマチン相互作用解析（ChIA-PET）において、ペアエンドタグシーケンシングと組み合わせることもできます。ChIA -PETは、高次クロマチン構造の大規模なde novo解析のために開発された技術です。^{[ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]}

• ChIPを用いた大規模アッセイは、無傷のモデル生物を用いると困難を伴う。これは、各転写因子（TF）ごとに抗体を作製する必要があるか、あるいはエピトープタグ付きTFを発現する遺伝子組み換えモデル生物を作製する必要があるためである。
• 小型生物における遺伝子発現の差異パターンを研究する研究者も、遺伝子が低レベルで、少数の細胞で、限られた時間枠内で発現するという問題に直面している。
• ChIP実験では、異なるTFアイソフォーム（タンパク質アイソフォーム）を区別することはできません。

• ChIP-exoは、ChIPプロセスにエキソヌクレアーゼ処理を追加することで、結合部位を最大で単一塩基対の解像度で解析できる技術である。
• ChIP-on-chipは、ChIPとマイクロアレイ技術を組み合わせたものです。
• DamIDは、特定の抗体を必要としない代替的な位置マッピング技術である。
• RIP-Chipは、RNAとタンパク質の相互作用を分析するための同様の技術である。

• 米国国立医学図書館の医学主題見出し（MeSH）におけるクロマチン＋免疫沈降法
• EpigenomeNOE.com
• 細胞および組織由来の未固定クロマチンに対するクロマチン免疫沈降法（ChIP）によるヒストン修飾の解析
• タンパク質複合体のクロマチン免疫沈降法（ChIP）：培養細胞における核タンパク質のゲノム標的のマッピング