生体共役

求核性リジン残基は、タンパク質バイオコンジュゲーションにおいて一般的に標的とされる部位であり、通常はアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS）エステルを介して行われる。^{[ 4 ]}最適な数の脱プロトン化リジン残基を得るには、水溶液のpHがリジンアンモニウム基のpKa （約10.5）より低くなければならないため、反応の典型的なpHは約8と9である。カップリング反応の一般的な試薬はNHSエステル（図1の最初の反応に示されている）であり、リジンアシル化機構を介して求核性リジンと反応する。他の同様の試薬はイソシアネートとイソチオシアネートであり、同様の機構を経る（図1の2番目と3番目の反応に示されている）。^{[ 2 ]}ベンゾイルフルオリド（図 1の最後の反応に示されている）は、穏やかな条件（低温、生理的pH）でタンパク質のリジン修飾を可能にするため、従来使用されてきたリジン特異的試薬の代替として最近提案された。^{[ 22 ]}

遊離システインはタンパク質表面にほとんど存在しないため、化学選択的修飾に最適な選択肢です。^{[ 23 ]}塩基性条件下では、システイン残基は脱プロトン化されてチオラート求核剤が生成され、これがマレイミドやヨードアセトアミドなどの軟らかい求電子剤と反応します（下の図2の最初の2つの反応に示されています）。その結果、炭素-硫黄結合が形成されます。システイン残基の別の修飾には、ジスルフィド結合の形成が含まれます（図2の3番目の反応に示されています）。還元されたシステイン残基は外因性ジスルフィドと反応し、タンパク質上に新しいジスルフィド結合を生成します。2-チオピリドンや3-カルボキシ-4-ニトロチオフェノールなどの過剰量のジスルフィドが反応を促進するためによく使用されます。^{[ 2 ] [ 4 ]}電子不足アルキンは、他の求核性アミノ酸残基が存在する場合でも、タンパク質のシステイン残基と選択的に反応することが実証されています。アルキンの置換基に応じて、これらの反応は、切断可能な（アルキノン誘導体を使用した場合）、^{[ 24 ]}または加水分解的に安定な生体共役体（3-アリールプロピオロニトリルを使用した場合、図 2の最後の反応）を生成する可能性があります。^{[ 25 ]}

チロシン残基は比較的反応性が低いため、バイオコンジュゲーションの一般的なターゲットではありませんでした。最近の開発により、チロシンは求電子芳香族置換（EAS）反応によって修飾でき、フェノール性ヒドロキシル基に隣接する芳香族炭素を選択的に修飾できることが示されています。 ^{[ 2 ]}これは、システイン残基をターゲットにできない場合に特に有用になります。具体的には、ジアゾニウムはチロシン残基と効果的に結合し（図3の最初の反応で試薬として示されているジアゾニウム塩）、ジアゾニウム塩の4位の電子吸引性置換基は、反応の効率を効果的に高めることができます。4-フェニル-1,2,4-トリアゾール-3,5-ジオン（PTAD）のような環状ジアゾジカルボキシアミド誘導体は、チロシン残基への選択的バイオコンジュゲーションに報告されています（図3の2番目の反応）。^{[ 26 ]}アルデヒドとアニリンを用いた3成分マンニッヒ型反応（図3の最後の反応）も、穏やかな最適化された反応条件下で比較的チロシン選択的であることが報告されている。^{[ 27 ]}

天然のアミノ酸残基は通常大量に存在するため、単一の部位を修飾することはしばしば困難です。タンパク質の末端を標的とする戦略が開発されてきました。これは、タンパク質修飾の部位選択性を大幅に向上させるためです。N末端修飾の1つは、末端アミノ酸の官能基化です。N末端セリンおよびトレオニン残基の酸化により、N末端アルデヒドが生成され、これがさらに生体直交反応を起こすことができます（図4の最初の反応を参照）。もう1つのタイプの修飾は、N末端システインとアルデヒドの縮合により、高pHで安定なチアゾリジンを生成することです（図4の2番目の反応を参照）。ピリドキサールリン酸（PLP）を使用すると、グリシンやアスパラギン酸など、いくつかのN末端アミノ酸がトランスアミノ化を起こしてN末端アルデヒドを生成することができます（図4の3番目の反応を参照）。

An example of C-termini modification is the native chemical ligation (NCL), which is the coupling between a C-terminal thioester and a N-terminal cysteine (Figure 5).

A ketone or aldehyde can be attached to a protein through the oxidation of N-terminal serine residues or transamination with PLP. Additionally, they can be introduced by incorporating unnatural amino acids via the Tirrell method or Schultz method.^[12] They will then selectively condense with an alkoxyamine and a hydrazine, producing oxime and hydrazone derivatives (shown in the first and second reactions, respectively, in Figure 6). This reaction is highly chemoselective in terms of protein bioconjugation, but the reaction rate is slow. The mechanistic studies show that the rate determining step is the dehydration of tetrahedral intermediate, so a mild acidic solution is often employed to accelerate the dehydration step.^[3]

The introduction of nucleophilic catalyst can significantly enhance reaction rate (shown in Figure 7). For example, using aniline as a nucleophilic catalyst, a less populated protonated carbonyl becomes a highly populated protonated Schiff base.^[28] In other words, it generates a high concentration of reactive electrophile. The oxime ligation can then occur readily, and it has been reported that the rate increased up to 400 times under mild acidic condition.^[28] The key of this catalyst is that it can generate a reactive electrophile without competing with desired product.

Recent developments that exploit proximal functional groups have enabled hydrazone condensations^[29] to operate at 20 M⁻¹s⁻¹ at neutral pH while oxime condensations have been discovered which proceed at 500-10000 M⁻¹s⁻¹ at neutral pH without added catalysts.^[30][31]

アジドとホスフィンのシュタウディンガーライゲーションは、化学生物学の分野で広く利用されています。生細胞や動物内で安定なアミド結合を形成できるため、細胞膜の修飾、生体内イメージング、その他のバイオコンジュゲーション研究に応用されています。^{[ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ]}

古典的なシュタウディンガー反応とは対照的に、シュタウディンガーライゲーションは、律速段階がホスファジドの生成である二次反応である（具体的な反応機構は図9に示す）。トリフェニルホスフィンはまずアジドと反応して4員環遷移状態を経てアザイリドを生成し、次に分子内反応によりイミノホスホラン中間体となり、加水分解によりアミド結合が生じる。^{[ 36 ]}

• Rh触媒によるTrpおよびCysアルキル化^{[ 47 ] [ 48 ]}

_{Rh 2} (OAc) ₄によるビニル置換ジアゾ化合物の活性化によってその場で生成された Rh ^II -カルベノイドを使用することで、トリプトファンとシステインが水性媒体中で選択的にアルキル化されることが示された。

しかし、この方法は立体的な制約のため、表面のトリプトファンとシステインに限定される可能性がある。^{[ 49 ]}

• Ir触媒によるリジンおよびN末端（還元）アルキル化^{[ 50 ]}

アルデヒドとリジンまたはN末端との縮合によって生成したイミンは、ギ酸イオン（ヒドリド源として機能する）の存在下で、水安定性の[Cp*Ir(bipy)(H₂O)]SO₄錯体によって効率的_に還元_することができる。この反応は生理学的に関連する条件下で容易に起こり、様々な芳香族アルデヒドに対して高い変換率をもたらす。

• Pd触媒によるチロシンOアルキル化^{[ 51 ]}

アリルアセテートまたはカルバメート前駆体から誘導された予め形成された求電子性π-アリルパラジウム(II)試薬を使用することにより、室温の水溶液中でシステインの存在下でチロシンの選択的アリルアルキル化を達成することができる。

• Au触媒によるCysアルキル化^{[ 52 ]}

システイン含有ペプチドは、金(I)塩および／または銀(I)塩の存在下でアレンとの1,2-付加反応を起こし、ヒドロキシル置換ビニルチオエーテルを生成することが示されている。ペプチドとの反応は高収率で進行し、他の求核性残基よりもシステインを選択的に反応させる。

しかし、タンパク質に対する反応性は大幅に低下しており、これはおそらく金がタンパク質の骨格に配位するためと考えられる。

• トリプトファンアリール化

トリプトファンC–Hアリール化を達成するための複数の方法が報告されており、アリールハライド^{[ 53 ] [ 54 ]}やアリールボロン酸^{[ 55 ]}（下記に示す例）などの多様な求電子剤がアリール基の転移に使用されている。

しかしながら、現在のトリプトファンC-Hアリール化反応の条件は依然として比較的厳しく、有機溶媒、低pH、および／または高温を必要とする。

• システインアリール化

遊離チオールは、Pd触媒の分解のため、Pd媒介反応には不利であると考えられてきた。^{[ 56 ]}しかし、ジアルキルビアリールホスフィン配位子で支持されたPd ^II酸化付加錯体（OAC）は、システインのS-アリール化に対して効率的に機能することが示されている。

^{最初の例は、Pd II} OAC とRuPhosの使用です。^{[ 57 ]}アリールハライドまたはトリフルオロメタンスルホン酸塩の酸化付加によって生成され、配位子として RuPhos を使用したPd ^II錯体は、中性 pH で 5% の有機共溶媒を含むさまざまな緩衝液中でシステインを化学選択的に修飾できます。この方法は、ペプチドやタンパク質の修飾、ペプチドのマクロ環化 (ビスパラジウム試薬と保護されていない 2 つのシステインを持つペプチドを使用) ^{[ 58 ]}、および抗体薬物複合体 (ADC) の合成に使用されていることが示されています。配位子をsSPhosに変更すると、Pd ^II錯体が十分に水溶性になり、共溶媒のない水性条件下でシステインの S-アリール化が達成されます。^{[ 59 ]}

この方法の他の応用例としては、SPPS中にペプチドに4-ハロフェニルアラニンを導入してペプチド-ペプチドまたはペプチド-タンパク質の連結を達成することにより、Pd ^{II錯体をPd II-}ペプチドOACとして生成するものがある。^{[ 60 ]}

ペプチドへの直接的な酸化付加の代替として、Pd OACはNHSエステルを介したアミン選択的アシル化反応によってタンパク質に転移させることもできる。後者は、タンパク質の表面リジン残基を選択的に標識するために適用され（Pd ^II -タンパク質OACを形成）、オリゴヌクレオチドも標識され（Pd ^II -オリゴヌクレオチドOACを形成）、その後、システイン含有ペプチドまたはタンパク質に結合させることができる。^{[ 61 ]}

タンパク質間クロスカップリングの別の例として、分子内酸化付加戦略を利用してシステイン残基を求電子性S-アリール-Pd-X OACに変換することによって達成される。^{[ 62 ]}

• Lysアリール化^{[ 63 ]}

システインと同様に、リジンのN-アリール化は、異なるジアルキルビアリールホスフィン配位子を用いたPd OACによって達成できる。システインと比較して求核性が弱く、還元的脱離速度が遅いため、支持配位子の選択が重要であることが示されている。かさ高いBrettPhosおよびt -BuBrettPhos配位子と弱塩基性フェノキシドナトリウムを組み合わせたものが、ペプチド基質上のリジンを官能基化する戦略として用いられてきた。この反応は穏やかな条件下で起こり、他のほとんどの求核性アミノ酸残基に対して選択性が高い。

Pd触媒によるSonogashira、Heck、およびSuzuki-Miyauraクロスカップリング反応は、ペプチドやタンパク質の修飾に広く応用されており、水溶液中での応用に向けて様々なPd試薬が開発されている。^{[ 64 ]これらの反応には、アルキン[ 65 ] [ 66 ] [ 67 ]}、アリールハライド^{[ 68 ] [ 69][ 70 ] [ 71 ] 、アリールボロン酸[ 72 ]} などの非天然官能基を有するタンパク質またはペプチド基質が必要であり、^{これは遺伝}暗号の拡張または翻訳後修飾によって実現できる。