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HaloTag は自己標識タンパク質タグです。これは細菌酵素に由来する 297 残基のタンパク質 (33 kDa) で、合成リガンドに共有結合するように設計されています。細菌酵素は、さまざまな目的のタンパク質に融合できます。[1]合成リガンドは、実行する実験の種類に応じて、利用可能ないくつかのリガンドから選択されます。この細菌酵素はハロアルカン脱ハロゲン化酵素で、加水分解酵素として機能し、目的のタンパク質の細胞内局在の可視化、目的のタンパク質の固定化、または生化学的環境内での目的のタンパク質の結合パートナーの捕捉を容易にするように設計されています。[2] HaloTag は、ハロアルカン脱ハロゲン化酵素と選択した合成リガンドを含む 2 つの共有結合セグメントで構成されています。これらの合成リガンドは、官能基に結合した反応性クロロアルカンリンカーで構成されています。[3]官能基はビオチン（親和性タグとして使用可能）か、クマリン、オレゴングリーン、Alexa Fluor 488、diAcFAM、TMRを含む5つの蛍光色素から選択できます。これらの蛍光色素は、生細胞または化学的に固定された細胞の可視化に使用できます。[4]
機構
HaloTag は、遺伝子組み換え活性部位を有する加水分解酵素であり、反応性クロロアルカンリンカーに特異的に結合し、リガンド結合速度が増加している。[5]タンパク質タグとクロロアルカンリンカーとの結合を形成する反応は、リンカー部分の末端塩素のため、生理学的条件下では高速かつ本質的に不可逆的である。[6]前述の反応では、クロロアルカン反応性リンカーの求核攻撃により、ハロゲンがアミノ酸残基に置換され、共有結合アルキル酵素中間体が形成される。この中間体は、その後、野生型加水分解酵素内のアミノ酸残基によって加水分解される。[7]これにより、反応後に酵素が再生される。しかし、改変ハロアルカン脱ハロゲン化酵素 (HaloTag) では、酵素の変異により反応中間体が加水分解されないため、後続の反応を進行させることができない。これにより中間体は安定した共有結合付加物として存続し、それに伴う逆反応は発生しない。[8]
用途
HaloTagged 融合タンパク質は、標準的な組み換えタンパク質発現技術を使用して発現できます。[9]さらに、目的の遺伝子を挿入するだけで使用できる市販のベクターがいくつかあります。[10]細菌の脱ハロゲン化酵素は比較的小さく、上記の反応は哺乳類細胞にとって外来性であるため、内因性の哺乳類代謝反応による干渉はありません。[11]融合タンパク質が発現されると、酵素アッセイ、細胞イメージング、タンパク質アレイ、細胞内局在の決定など、さまざまな実験領域の可能性が広がります。[12]
最近、HaloTagは、ニューロン活動のハイブリッドタンパク質+小分子バイオセンサーを作成するために設計されました。[13]これらのセンサーは、ニューロンの発火中にカルシウム濃度の急上昇に反応して構造変化を起こします。この構造変化は、HaloTagに結合した染料分子の構造を調節します。[13]
参照
参考文献
- ^ Los GV、Encell LP、McDougall MG、 Hartzell DD、Karassina N、Zimprich C、他 (2008 年 6 月)。「HaloTag: 細胞イメージングとタンパク質分析のための新しいタンパク質標識技術」ACS Chemical Biology。3 ( 6): 373–82。doi :10.1021/cb800025k。PMID 18533659 。
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