固相ペプチド合成 合成ペプチドの製造に確立された方法は、固相ペプチド合成（SPPS）として知られています。[ 2 ] ロバート・ブルース・メリフィールド によって開拓された[ 5 ] [ 6 ] SPPSは、成長中のペプチド鎖が巨視的に不溶性の溶媒膨潤ビーズ樹脂支持体に付着している間に 、 [ 7 ]
固体支持体の特性 固体支持体は、新生ペプチド鎖を樹脂ポリマーに結合させるために使用できる反応性基（アミン基やヒドロキシル基など）で官能化された、小さな（直径約50～100マイクロメートル）ポリマー樹脂ビーズで構成されています。[ 2 ] 合成中は、リンカー分子 を使用してペプチド鎖と樹脂を一緒に保持することが最も一般的です。ペプチドは合成全体を通して樹脂支持体に共有結合したままです。各アミノ酸の添加に関わる化学ステップの後、過剰な試薬と可溶性副生成物は、簡単な溶媒洗浄とろ過によって除去できます。このアプローチにより、従来の溶液相合成を使用する場合に必要となる、各反応ステップ後の生成物ペプチドのクロマトグラフィーによる分離を回避できます。[ 7 ]
一般的なSPPS手順 段階的SPPSは、樹脂支持体に共有結合した標的ペプチド鎖のC末端アミノ酸残基から始まる。樹脂に結合した新生ペプチド鎖のN末端に結合する各アミノ酸は、使用する保護戦略に応じて、 Boc （酸不安定性）またはFmoc （塩基不安定性）などの保護基を使用して、そのαアミノ基を保護する必要がある（下記参照）。[ 1 ]
一般的な SPPS 手順は、N 末端脱保護とペプチド結合形成の「カップリング」反応を交互に繰り返すサイクルです。樹脂は、各化学反応ステップの間に有機溶媒で洗浄されます。[ 2 ] [ 8 ]
標的ペプチドのC末端アミノ酸のNαアミンは、Fmoc基またはBoc基で保護されている。 保護されたアミノ酸は、樹脂ビーズに結合した遊離アミノ基と結合している。 保護グループが削除されます（保護グループスキームを 参照）。 N 保護基を持つ2番目のアミノ酸は、1番目のアミノ酸と結合する。カップリング試薬はペプチド結合の形成を促進する。上記のサイクルは、目的の配列が合成されるまで繰り返される。 必要に応じて、N 末端アミノ基をキャッピングすることで、樹脂に結合した未反応ペプチドのさらなる反応を防ぐことができる。 ペプチドと樹脂を結合しているリンカーを化学的に切断してペプチドを遊離させる。 粗生成物は、以下のいずれかの方法で精製される。 固相ペプチド合成（PG ：保護基） SPPSは、副生成物が指数関数的に蓄積するため反応収率 が制限され、通常、40または50アミノ酸残基の範囲のペプチドやタンパク質は、明確な化学構造を持つ均一な分子としてのSPPS生成物の合成のアクセス可能性の限界を押し上げています。 [ 2 ] 合成の難しさは配列にも依存します。通常、アミロイド [ 12 ] ネイティブケミカルライゲーションなどのアプローチを使用することでアクセスできます。
アミノ酸カップリング試薬 SPPS の幅広い応用を可能にした重要な特徴は、カップリング段階で極めて高い収率が得られることです。[ 2 ] アミド 結合形成条件が必要です。ペプチド合成における最適でないカップリング収率の影響を説明するために、各カップリング段階の収率が少なくとも 99% である場合を考えてみましょう。この場合、26 アミノ酸ペプチドの全体的な粗収率は 77% になります (各脱保護の収率が 100% であると仮定)。各カップリングの効率が 95% であれば、全体の収率は 25% になります。[ 13 ] [ 14 ] カップリング収率を最大化するために、各 SPPSカップリング反応 では、各アミノ酸を大過剰 (2 ～ 10 倍) で使用することがよくあります。カップリング中のアミノ酸のラセミ化を 最小限に抑えることも、最終ペプチド生成物のエピマー化を 避けるために非常に重要です。
アミンとカルボン酸の間のアミド結合形成には、N-α保護アミノ酸反応物のカルボキシル基を活性化するための「カップリング試薬」が必要です。カップリング試薬は、特定のカップリングに対する有効性が異なるため、幅広い種類が存在し、[ 15 ] [ 16 ]
アミジニウム塩およびホスホニウム塩 カルボジイミド試薬を使用したときに形成される O-アシルイソ尿素中間体によるエピマー化を避けるために、アミジニウム 試薬またはホスホニウム 試薬を使用することができます。これらの試薬は、カルボン酸を脱酸素化する求電子部分 (青 ) とマスクされた求核部分 (赤 ) の 2 つの部分から構成されています。カルボン酸が求電子性アミジニウムまたはホスホニウム部分に求核攻撃すると、短寿命の中間体が生成され、これがマスクされていない求核剤によって迅速に捕捉されて、活性エステル中間体と尿素 またはホスホラミド副生成物が形成されます。これらのカチオン試薬は、 ヘキサフルオロリン酸塩 またはテトラフルオロホウ酸 塩などの非配位性対アニオンを有しています。[ 13 ] H T HBTU およびHATU に加えて、他の一般的な試薬にはHCTU (6-ClHOBt)、TCFH (塩化物)、COMU (エチルシアノ(ヒドロキシイミノ)アセテート) があります。ヒドロキシベンゾトリアゾール 部分を含むアミジニウム試薬は、N 型 (グアニジニウム) または O 型 (ウロニウム) で存在できますが、N 型の方が一般的に安定です。[ 20 ] BOP (HOBt)、PyBOP (HOBt)、PyAOP (HOAt) があります。[ 21 ] [ 22 ] グアニジノ 副生成物を形成できますが、ホスホニウム試薬はそうではありません。[ 23 ]
頑丈な支持構造 SPPSで最も一般的に使用される固体支持体は架橋ポリスチレンです。この画像は誤りです。架橋剤はメタジビニルベンゼンです。 ペプチド合成用の固体支持体は、液体の迅速な濾過を可能にするために、物理的安定性に基づいて選択されます。適切な支持体は、SPPS中に使用される試薬および溶媒に対して不活性であり、最初のアミノ酸の結合を可能にします。[ 25 ] [ 26 ]
主要な固体支持体は、懸濁重合コポリ（1% m-ジビニル＋スチレン）ビーズ樹脂である。[ 25 ] [ 27 ] 1996年時点で [ 28 ]
保護対象グループ制度 上述のように、ペプチド合成において、活性化アミノ酸の自己カップリングによる重合などの望ましくない副反応を避けるためには、N末端および側鎖保護基の使用が不可欠 である。 [ 1 ] これ
固相ペプチド合成では、一般的に 2 つの主要な保護基スキームが使用されます。いわゆる Boc/ベンジル法と Fmoc/ tert- ブチル法です。[ 2 ] TFA に不安定な N 末端Boc 保護と側鎖保護が利用され、側鎖保護は最終切断ステップで無水フッ化水素を使用して除去されます (同時にペプチドが固相担体から切断されます)。Fmoc/tBu SPPS では、塩基に不安定な Fmoc N 末端保護が使用され、[ 29 ]
Boc基の切断 SPPSが登場する以前は、化学ペプチド合成の溶液法では、一時的なN末端α-アミノ保護基としてtert-ブチルオキシカルボニル（略称「Boc」）が用いられていました。Boc基は、 トリフルオロ酢酸 （TFA）などの酸で除去されます。これにより、過剰のTFAの存在下で正に帯電したアミノ基が形成され（右の画像ではアミノ基はプロトン化されていないことに注意）、これが中和されて、導入される活性化アミノ酸と結合します。[ 30 ] その場でも起こり得ます。
Boc/Bzl法は、合成中のペプチド凝集を 低減する上で依然として有用である。[ 31 ] デプシペプチドやチオエステル部分など）を含むペプチドを合成する場合、Fmoc脱保護ステップ中に塩基処理が必要となるため（下記参照）、Boc/ベンジルSPPS法はFmoc/ tert- ブチル法よりも好ましい場合がある。
Boc/ベンジルSPPSで使用される永久側鎖保護基は、通常ベンジル基またはベンジルベースの基である。[ 1 ] フッ化水素 を用いた加水分解による側鎖脱保護と同時に起こる。最終生成物はフッ化物塩であり、比較的容易に溶解する。反応性カチオンが望ましくない副生成物を生成するのを防ぐために、クレゾール などのスカベンジャーをHFに添加する必要がある。
t Bu SPPSFmoc基の開裂。Fmoc 保護アミンをピペリジンで処理すると、 フルオレニル 環系のメチン基 からプロトンが引き抜かれる。これによりカルバメート が放出され、これが二酸化炭素（CO₂ ） ジベンゾフルベン も生成される。この反応は、生成した芳香族 アニオンの安定化によって生じるフルオレニル プロトンの酸性度により起こる。副生成物であるジベンゾフルベンは、ピペリジン（大過剰）などの 求核剤 、または放出されたアミンと反応する可能性がある。 [ 32 ] N末端Fmoc 脱保護スキームの使用は、 SPPS条件下では真に直交的である。 [ 33 ] Fmoc脱保護は、通常DMF 中の20～50%ピペリジンを 使用する塩基触媒脱離反応である。[ 25 ] tBu SPPSでは凝集のリスクが増加する可能性がある。遊離したフルオレニル基は発色団であるため、Fmoc脱保護は反応混合物のUV吸収によってモニターすることができ、これは自動ペプチド合成装置で採用されている戦略である。
Fmoc基は比較的穏やかな塩基性条件下で切断され、酸に対して安定であるため、BocやtBuなどの側鎖保護基を、Boc /Bzl SPPS（HF）での最終切断に使用される条件よりも穏やかな酸性の最終切断条件（TFA）で除去することができます。水やトリイソプロピル シラン（TIPS）などのスカベンジャーは、側鎖脱保護の結果として放出される反応性カチオン種との副反応を防ぐために、最終切断中に最も一般的に添加されます。ただし、他の多くのスカベンジャー化合物も使用できます。[ 34 ] [ 35 ] [ 36 ]
Fmoc/ tBu SPPSは、フルオレニル基の質量がBoc基よりもはるかに大きいため、原子効率が 劣ります。さらに、Fmocアミノ酸の価格は、1990年代に最初の合成ペプチド医薬品の1つであるエンフビルチド の大規模な試験生産が始まるまで高止まりしていましたが、市場の需要によってFmocアミノ酸とBocアミノ酸の相対価格が調整されました。
その他の保護団体
ベンジルオキシカルボニル (Z)基は、 1930年代初頭にレオニダス・ゼルバス によって発見された別のカルバメート型アミン保護基であり、通常はクロロホルメートベンジル との反応によって付加される。[ 37 ]
ベンジルクロロホルメート（Z-クロリド）との反応を防ぐためのZ保護基の導入 酢酸 中の臭化水素酸 を用いた過酷な条件下、または接触水素化 によるより穏やかな条件下で除去される。
この方法は、 1932年にゼルバスとマックス・ベルクマン によってオリゴペプチドの合成に初めて使用されました。[ 38 ] [ 37 ] ラセミ化 することも防止しました。[ 37 ] [ 38 ]
ベルクマン・ゼルバス法は、発表後20年間ペプチド化学の標準的な手法として用いられ、1950年代初頭に新しい方法（Boc保護基など）に取って代わられた。[ 37 ]
固相法による天然ペプチド合成では、複数の天然ジスルフィドの形成が依然として課題となっている。ランダムな鎖の組み合わせでは、通常、非天然ジスルフィド結合を持つ複数の生成物が生じる。[ 44 ] [ 45 ]
ペプチド合成において、後続の位置選択的なジスルフィド結合形成を必要とするチオール保護基は、複数の特性を備えている必要がある。[ 46 ] [ 47 ] tert- ブチル (But)、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル (NPYS)、2-ピリジンスルフェニル (Pyr)、およびトリチル (Trt) 基がある。[ 46 ] [ 48 ]
この方法を用いて、木曽らは1993年にインスリンの全合成を初めて報告した。[ 49 ] [ 49 ]
マイクロ波支援ペプチド合成 マイクロ波支援ペプチド合成は、Fmoc化学SPPSを補助するためによく使用される。[ 50 ] [ 51 ]
連続フロー固相ペプチド合成 連続フローペプチド合成に関する最初の論文は1986年に発表されましたが[ 52 ] [ 53 ] [ 54 ] [ 55 ]
UV/Vis分光法や樹脂量を監視する可変床流量反応器（VBFR）の使用などのインライン分析のおかげで、樹脂上の凝集を特定し、カップリング効率を評価することができます。[ 56 ]
長鎖ペプチドの合成 連続するアミノ酸を一度に 1 つずつ追加する段階的伸長法は、2 ～ 40 個 (まれに 50 個まで) のアミノ酸残基を含む小さなペプチドに最適です。より長いポリペプチド鎖の合成には、保護されていないペプチドセグメントを結合するセグメント縮合法が使用されます。 [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ]
より長いペプチド鎖を生成するための重要な開発は化学的連結 であり、これは保護されていないペプチド鎖が水溶液中で非ペプチド結合の形成によって化学選択的に縮合される。最も一般的に使用される反応はネイティブ化学的連結 であり、ペプチドチオエステルがN末端システイン残基と反応する。[ 61 ]
組換え生産されたポリペプチドを水溶液中で共有結合させる方法には、スプリットインテイン [ 62 ] [ 63 ] ソーターゼライゲーション [ 64 ]
長いペプチド の合成を最適化するために、メディコンバレーでは ペプチド配列 を変換する方法が開発されました。 単純なプレシークエンス（例：リジン （Lysn）、グルタミン酸 （Glun）、（LysGlu）n）をペプチドのC末端 に組み込むことで、 αヘリックス 様の構造を誘導します。これにより、薬理活性 や作用プロファイルを変えることなく、生物学的半減期 を延長し、ペプチドの安定性を向上させ、酵素分解を阻害できる可能性があります。 [ 65 ] [ 66 ]
環状ペプチド
樹脂の環化について ペプチドは固相担体上で環化する ことができる。HBTU/HOBt/DIEA、PyBop/DIEA、PyClock/DIEAなどの様々な環化試薬を用いることができる。 [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ]
環状ペプチドの固相合成戦略は、Asp、Glu、またはLys側鎖を介した結合に限定されません。システインは側鎖に非常に反応性の高いスルフィドリル基を持っています。ジスルフィド結合は、1つのシステインの硫黄原子が、タンパク質の別の部分にある2番目のシステインの別の硫黄原子と単一の共有結合を形成するときに形成されます。これらの結合は、特に細胞から分泌されるタンパク質の安定化に役立ちます。一部の研究者は、ジスルフィド結合の形成を阻害しつつ、システインとタンパク質の元の一次構造を維持するために、S-アセトアミドメチル（Acm）を使用して修飾システインを使用しています。[ 70 ]
γ- 、δ- 、ε-ラクタム などの小さなC末端環状部分は、側鎖にアミンを持つC末端アミノ酸の保護を解除し、環化させることで、塩基不安定性リンカー 上で合成されたペプチドに導入することができ、その過程でペプチドが樹脂から遊離する。[ 75 ]
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