生体直交化学

バイオ直交化学という用語は、本来の生化学プロセスを妨害することなく生体システム内で起こり得る化学反応を指します。 ^{[1] [2] [3]}この用語は、2003年にキャロリン・R・ベルトッツィによって造られました。 ^{[4] [5]導入されて以来、バイオ直交反応の概念により、細胞毒性なしに生体システム内でリアルタイムで}グリカン、タンパク質、^[6]、脂質^[7]などの生体分子の研究が可能になりました。生体直交性の要件を満たす多くの化学連結戦略が開発されており、その中には、アジドとシクロオクチン間の1,3-双極子環状付加（銅フリークリックケミストリーとも呼ばれる）^{[8] 、}ニトロンとシクロオクチン間の^[9]、アルデヒドとケトンからのオキシム/ヒドラゾン形成、^[10]テトラジン連結、^[11]イソシアニドベースのクリック反応、^[12]そして最近ではクアドリシクラン連結^[13]が含まれます。

バイオ直交化学の使用は、通常、2 つのステップで進行します。まず、細胞基質をバイオ直交官能基 (化学レポーター) で修飾し、細胞に導入します。基質には代謝物、酵素阻害剤などが含まれます。化学レポーターは、基質の生物活性に影響を与えないように、基質の構造を大幅に変更してはなりません。次に、相補的な官能基を含むプローブを導入し、基質と反応させて標識します。

銅を使用しないクリックケミストリーなどの効果的なバイオオルソゴナル反応が開発されているが、新しい反応の開発により、同じ生物系で複数の標識方法を使用できるように、標識のための直交方法が生み出され続けている。キャロリン・R・ベルトッツィは、クリックケミストリーとバイオオルソゴナル化学の開発により、2022年にノーベル化学賞を受賞した。^[14]

バイオオルソゴナルという言葉は、ギリシャ語のbio-「生きている」とorthogōnios「直角の」に由来しています。つまり、文字通り、生体システムに対して垂直に反応し、生体システムを乱さないということです。

生体直交性があるとみなされるには、反応はいくつかの要件を満たす必要があります。

• 選択性:生物学的化合物との副反応を避けるために、反応は内因性官能基間で選択的である必要があります。
• 生物学的不活性:反応パートナーおよび結果として生じる結合は、研究対象生物の本来の化学的機能性を破壊する可能性のあるいかなる反応モードも有してはなりません。
• 化学的不活性:共有結合は強力で、生物学的反応に対して不活性である必要があります。
• 速度論:プローブの代謝とクリアランスの前に共有結合が達成されるように、反応は迅速でなければなりません。反応の競合によって、より少ない種の小さな信号が減少するのを防ぐため、反応は細胞プロセスの時間スケール (分) で迅速でなければなりません。迅速な反応は、動的プロセスを正確に追跡するために必要な、迅速な応答も提供します。
• 反応の生体適合性:反応は無毒でなければならず、pH、水性環境、温度を考慮した生物学的条件下で機能する必要があります。生体直交化学が生きた動物モデルに拡大するにつれて、薬物動態に対する関心が高まっています。
• アクセス可能なエンジニアリング:化学レポーターは、何らかの代謝またはタンパク質エンジニアリングを介して生体分子に組み込むことができなければなりません。最適なのは、官能基の 1 つが非常に小さく、本来の動作を妨げないことです。

シュタウディンガー連結反応は、2000年にベルトッツィグループによって開発された反応で、アジドとトリアリールホスフィンの古典的なシュタウディンガー反応に基づいています。 ^[15]これは完全に非生物的な官能基を持つ最初の反応としてバイオオルソゴナル化学の分野を切り開きましたが、今ではそれほど広く使用されていません。シュタウディンガー連結反応は、生細胞と生きたマウスの両方で使用されています。^[5]

アジドは、ホスフィンなどのソフトな求核剤を好むソフトな求電子剤として作用します。これは、通常ハードな求核剤であるほとんどの生物学的求核剤とは対照的です。反応は、水耐性条件下で選択的に進行し、安定した生成物を生成します。

ホスフィンは生体システムから完全に排除されており、軽度の還元電位があるにもかかわらず、ジスルフィド結合を還元しません。アジドは、アジドチミジンなどの FDA 承認薬や、架橋剤としてのその他の用途で生体適合性があることが実証されています。さらに、サイズが小さいため、細胞の代謝経路を通じて生体分子に簡単に組み込むことができます。

求核性ホスフィンは、求電子性末端窒素でアジドを攻撃します。4 員遷移状態を経て、N _{2 が}失われ、アザイリドが形成されます。不安定なイリドは加水分解されて、ホスフィンオキシドと第一級アミンを形成します。ただし、加水分解によってアザイリドの共有結合が切断されるため、この反応は直ちに生体直交性になるわけではありません。

反応は、エステルを局所濃度を高めるように配置すると、即時の加水分解に打ち勝つために、アザイリドを新しい反応経路に導くために、アリール環の 1 つにリン原子のオルト位にエステル基を含めるように変更されました。アジドに対する最初の求核攻撃が律速段階です。イリドは分子内環化によって求電子エステル トラップと反応し、5 員環を形成します。この環は加水分解を受けて、安定したアミド結合を形成します。

ホスフィン試薬は生体内でゆっくりと空気酸化されます。さらに、体外でシトクロム P450酵素によって代謝されると考えられます。

反応速度は遅く、2 次速度定数は約 0.0020 M ⁻¹ •s ⁻¹です。ホスフィンに電子供与基を追加して求核攻撃速度を上げようとすると、速度は改善されましたが、空気酸化速度も増加しました。

反応速度論が悪いため、高濃度のホスフィンを使用する必要があり、イメージングアプリケーションではバックグラウンド信号が高くなるという問題が生じる。フルオレセインとルシフェリンをベースにした蛍光ホスフィン試薬の開発を通じて、高バックグラウンドの問題に対処する試みがなされてきたが、固有の反応速度論が依然として限界となっている。^[16]

銅を使わないクリックケミストリーは、カール・バリー・シャープレスらの研究に基づき、アジドアルキンヒュスゲン環化付加の活性化バリアントとしてキャロライン・ベルトッツィが初めて開発した生体直交反応である。CuAACとは異なり、銅を使わないクリックケミストリーは細胞毒性銅触媒を排除することで生体直交になるように改良されており、反応が迅速に進行し、生細胞に毒性を及ぼさないようになっている。銅の代わりに、反応は歪み促進アルキン-アジド環化付加（SPAAC）である。これはシュタウディンガー連結反応のより高速な代替法として開発され、第一世代は60倍以上も速く反応した。反応の生体直交性により、銅を使わないクリック反応を培養細胞、生きたゼブラフィッシュ、マウスに適用できるようになった。

古典的な銅触媒アジド-アルキン環化付加反応は、バイオコンジュゲーションのための極めて高速かつ効果的なクリック反応ですが、Cu(I)イオンの毒性のため、生細胞での使用には適していません。毒性は、銅触媒によって形成される活性酸素種による酸化損傷によるものです。銅錯体は細胞代謝の変化を誘発し、細胞に取り込まれることもわかっています。

生体分子の損傷を防ぎ、 in vitroアプリケーションでの除去を容易にするリガンドの開発がいくつか行われてきました。しかし、複合体の異なるリガンド環境は依然として代謝と取り込みに影響を及ぼし、細胞機能に望ましくない混乱を引き起こす可能性があることが判明しました。^[17]

アジド基は極めて小さく（細胞透過性に有利で摂動を避ける）、代謝的に安定しており、細胞内に天然には存在しないため競合する生物学的副反応がないため、特に生体直交性が高い。アジドは反応に利用できる最も反応性の高い1,3-双極子ではないが、一般的な合成条件では副反応が比較的少なく安定しているため好まれている。^[18]アルキンはそれほど小さくはないが、それでも生体内標識に必要な安定性と直交性を備えている。シクロオクチンは、最小の安定したアルキン環であるため、標識研究で伝統的に最も一般的なシクロアルキンである。

この反応は、標準的な 1,3-双極子環化付加反応として進行し、非同期の協調的環周シフトの一種である。1,3-双極子の両価性により、アジド上の求電子中心または求核中心の特定は不可能となり、環式電子流の方向は無意味となる。[p] しかし、計算により、窒素間の電子分布により、最も内側の窒素原子が最大の負電荷を帯びることがわかった。^[19]

この反応ではトリアゾールの位置異性体混合物が生成されるが、反応の位置選択性の欠如は、現在のほとんどの用途では大きな問題ではない。特に、末端アルキンの付加と比較して、歪んだシクロオクチンの合成の合成の難しさを考えると、位置特異性が高く、生体直交性の要件が少ない場合は、銅触媒ヒュイスゲン付加環化が最も適している。

OCT は、銅フリークリックケミストリー用に開発された最初のシクロオクチンです。直鎖アルキンは生理的温度では反応しませんが、OCT は生物学的条件下でアジドと容易に反応し、毒性を示しませんでした。しかし、OCT は水溶性が低く、反応速度はシュタウディンガー連結反応に比べてほとんど改善されませんでした。ALO (アリールレスオクチン)は水溶性を改善するために開発されましたが、それでも反応速度は悪かったです。

モノフッ素化（MOFO）およびジフッ素化（DIFO ）シクロオクチンは、プロパルギル位に電子吸引性のフッ素置換基を付加することで速度を上げるために作られた。フッ素は、合成のしやすさと生物学的不活性の点で優れた電子吸引基である。特に、生物学的求核剤と副反応する可能性のある求電子性マイケル受容体を形成できない。^[8] DIBO（ジベンゾシクロオクチン）は、2つのアリール環への融合として開発され、非常に高い歪みと歪みエネルギーの減少をもたらした。ビアリール置換により環歪みが増加し、アルキンとの共役が提供されて反応性が向上すると提案された。計算ではモノアリール置換が立体的衝突（アジド分子と）と歪みの間の最適なバランスを提供することが予測されていたが、^[20]モノアリール化製品は不安定であることが示された。

BARAC（ビアリールアザシクロオクチノン）に続いてアミド結合を加えると、sp ²のような中心が追加され、歪みによって速度が上昇します。アミド共鳴は、不安定な分子につながる追加の不飽和を生じさせることなく、追加の歪みをもたらします。さらに、シクロオクチン環にヘテロ原子を追加することで、分子の溶解性と薬物動態の両方が向上します。BARACは十分な速度（および感度）を備えているため、バックグラウンドを減らすために余分なプローブを洗い流す必要はありません。これにより、リアルタイムイメージングや動物全体のイメージングなど、洗浄が不可能な状況で非常に役立ちます。BARACは非常に便利ですが、安定性が低いため、光と酸素から保護して0°Cで保管する必要があります。^[21]

BARAC をさらに調整してDIBAC/ADIBO を生成することで、遠位環歪みを追加し、アルキン周囲の立体構造を減らして反応性をさらに高めました。ヒドロキシル基がケトンに変換されたケト-DIBO は、環の立体配座の変化により反応速度が 3 倍に増加します。ジフルオロベンゾシクロオクチン ( DIFBO ) を生成しようとする試みは、不安定性のため失敗しました。

マウスの生体内研究におけるDIFOの問題は、生体直交反応を起こすことの難しさを物語っています。DIFOは細胞の標識において非常に反応性が高いのですが、マウスの研究では血清アルブミンと結合するため、あまり効果がありません。シクロオクチンの疎水性は膜や血清タンパク質による隔離を促進し、生体利用可能な濃度を低下させます。これに対応して、水溶性、極性、薬物動態を向上させるためにDIMAC（ジメトキシアザシクロオクチン）が開発されましたが^[22]、マウスモデルの生体直交標識の取り組みはまだ開発中です。

計算による取り組みは、これらの付加環化反応の熱力学と速度論を説明する上で不可欠であり、反応を継続的に改善する上で重要な役割を果たしてきました。安定性を犠牲にすることなくアルキンを活性化する方法は 2 つあります。遷移状態エネルギーを低下させるか、反応物の安定性を低下させるかです。

反応物安定性の低下: Houk ^[23]は、アジドとアルキンを遷移状態の形状に歪ませるのに必要なエネルギー (E _d ^‡ )の差が、反応の障壁の高さを制御すると提唱しています。活性化エネルギー (E ^{‡ ) は、不安定化歪みと安定化相互作用 (E} _i ^‡ )の合計です。最も顕著な歪みはアジド官能基にあり、アルキン歪みの寄与はより少ないです。しかし、反応性を高めるために簡単に変更できるのはシクロオクチンだけです。フェニルアジドとアセチレン(16.2 kcal/mol) とシクロオクチン (8.0 kcal/mol) の計算された反応障壁は、10 ⁶の予測速度増加をもたらします。シクロオクチンはより少ない歪みエネルギー (1.4 kcal/mol 対 4.6 kcal/mol) を必要とするため、相互作用エネルギーが小さいにもかかわらず、活性化エネルギーは低くなります。

遷移状態エネルギーの減少：フッ素などの電子吸引基は、LUMOエネルギーとHOMO-LUMOギャップを減少させることで速度を増加させます。これにより、遷移状態でアジドからフッ素化シクロオクチンへの電荷移動が増加し、相互作用エネルギー（負の値が低い）と全体的な活性化エネルギーが増加します。^[24] LUMOの低下は、アルキンπドナー軌道とCF σ*アクセプター間の超共役の結果です。これらの相互作用は、結合が歪むにつれてドナー/アクセプター能力が増加する結果として、主に遷移状態で安定化をもたらします。NBO計算では、遷移状態の歪みにより相互作用エネルギーが2.8 kcal/mol増加することが示されています。

面外π結合間の超共役は、面内π結合の整列が不十分なため、より大きくなります。しかし、遷移状態の曲がりにより、面内π結合は相互作用を容易にするより反ペリプラナーな配置をとることができます。追加の超共役相互作用エネルギーの安定化は、CN結合の形成によるσ*の電子分布の増加によって達成されます。σ*CF結合との負の超共役は、この安定化相互作用を強化します。^[19]

位置選択性は、銅を含まないクリックケミストリーの現在のイメージングアプリケーションでは大きな問題ではないが、薬物設計やペプチド模倣物などの分野での将来の応用を妨げる問題である。^[25]

現在、ほとんどのシクロオクチンは反応して位置異性体混合物を形成する。[m] 計算解析により、気相位置選択性は1,5付加が1,4付加よりも活性化エネルギーで最大2.9 kcal/mol有利であると計算されているが、溶媒和補正により両方の位置異性体に対して同じエネルギー障壁が生じることが判明した。DIFOの環化付加における1,4異性体はその大きな双極子モーメントにより不利であるが、溶媒和により1,5異性体よりも強く安定化され、位置選択性が低下する。^[24]

BCN （ビシクロ[6.1.0]ノニン）などの対称シクロオクチンは、環化付加により単一の位置異性体を形成し^[26]、将来的にこの問題を解決するのに役立つ可能性がある。

銅を使用しないクリックケミストリーの最も広範な応用は、アジドタグ付き生体分子とイメージング剤を含む シクロオクチンを使用した、生きた細胞または動物の生物学的イメージングです。

DIBOの蛍光ケトおよびオキシム変異体は、反応中に形成されるトリアゾールによってシクロオクチンの蛍光が消光される蛍光スイッチクリック反応に使用されます。^[27]一方、クマリン共役シクロオクチン、例えばcoumBARACは、アルキンが蛍光を抑制し、トリアゾールの形成によって蛍光量子収率が10倍に増加するように開発されています。 ^[28]

光活性化シクロオクチンを用いて基質標識の空間的および時間的制御が研究されている。これにより、反応前にアルキンを平衡化することができ、濃度勾配によるアーティファクトを減らすことができる。マスクされたシクロオクチンは暗闇ではアジドと反応できないが、光照射により反応性アルキンになる。^[29]

銅を使わないクリックケミストリーは、投与前の同位体崩壊を最小限に抑えるために、高純度かつ高収率で迅速に製造する必要があるPETイメージング剤の合成に使用するために研究されています。SPAACの高い速度定数と生体直交性は、PET化学に適しています。^[30]

銅を使用しないクリックケミストリーは、アジドではなくニトロンを1,3-双極子として使用するように適応されており、ペプチドの修飾に使用されています。^[9]

ニトロンとシクロオクチンのこの環化付加により、N-アルキル化イソキサゾリンが形成される。反応速度は水によって促進され、ニトロンの置換に応じて2次反応速度定数が12～32 M ⁻¹ •s ⁻¹と極めて高速である。反応は非常に高速であるが、代謝標識によってニトロンを生体分子に組み込む際に問題が生じる。標識は翻訳後ペプチド修飾によってのみ実現されている。

1,3双極子環化付加反応は、ニトリルオキシドを1,3双極子として、ノルボルネンを双極子親和体として用いる生体直交反応として開発されている。主な用途は、自動オリゴヌクレオチド合成装置におけるDNAおよびRNAの標識化^[31]、および生細胞の存在下でのポリマー架橋である。 ^[32]

ノルボルネンは、ひずみ促進反応性と安定性のバランスが取れているため、双極子親和剤として選択されました。この反応の欠点としては、強い求電子性によるニトリルオキシドの交差反応性と、反応速度の遅さが挙げられます。

オキサノルボルナジエンの付加環化は、1,3-双極子付加環化の後に逆ディールス・アルダー反応が起こり、フラン分子が脱離してトリアゾール結合共役体を生成する。^{[33]予備研究により、ペプチド標識実験におけるその有用性が確立されており、} SPECTイメージング化合物の生成にも使用されている。^[34]最近では、オキサノルボルナジエンの使用が、モデルアミノ酸が金属部分に結合した、触媒を使用しない室温「iClick」反応で説明され、バイオオルトゴナル反応への新しいアプローチとなっている。^[35]

オキサノルボルナジエンの環歪みと電子不足により、環化付加の律速段階への反応性が高まります。その後すぐに逆ディールス・アルダー反応が起こり、安定した 1,2,3 トリアゾールが形成されます。問題点としては、オキサノルボルナジエンの電子構造を変化させる可能性のある置換基に対する耐性が低いことと、反応速度が遅いこと（2 次反応速度定数が 10 ⁻⁴程度）が挙げられます。

テトラジン連結反応は、トランス-シクロオクテンとs-テトラジンとの逆要求ディールス・アルダー反応とそれに続く逆ディールス・アルダー反応により窒素ガスを除去する反応である。^[36]この反応は極めて速く、2次反応速度定数は2000 M ⁻¹ –s ⁻¹（メタノール/水中9:1）であり、極めて低濃度での生体分子の修飾を可能にする。

バッハの計算によると、Z-シクロオクテンのひずみエネルギーは、2つのトランスアニュラー相互作用の損失により、シクロオクタンの12.4 kcal/molと比較して7.0 kcal/molです。E-シクロオクテンは、高度にねじれた二重結合を持ち、ひずみエネルギーは17.9 kcal/molです。^[37]そのため、高度に歪んだトランス-シクロオクテンが反応性ジエノフィルとして使用されます。ジエンは、水との即時反応に耐えるために置換された3,6-ジアリール-s-テトラジンです。反応は、最初の環化付加を経て進行し、その後、N2を除去して_反応の可逆性を防ぎます。^[11]

この反応は水に対して耐性があるだけでなく、水性媒体中では反応速度が上昇することが分かっています。反応は、ノルボルネンをジエノフィルとして使用して水性媒体中で1 M ⁻¹ •s ^{−1のオーダーの2次速度で行われています。この反応は生細胞の標識[38]}やポリマーカップリングに応用されています。^[39]

_{このイソシアニドクリック反応は[4+1]環化付加反応に続いてN2}の逆ディールスアルダー脱離反応が起こる。^[12]

反応は、最初の [4+1] 環化付加反応から始まり、その後、熱力学的シンクを除去して可逆性を防ぐための逆反応が続きます。この生成物は、三級アミンまたはイソシアノプロパノエートを使用すると安定します。二級または一級イソシアニドを使用すると、生成物はすぐに加水分解されるイミンを形成します。

イソシアニドは、サイズが小さく、安定しており、毒性がなく、哺乳類のシステムには存在しないため、化学レポーターとして好まれています。ただし、反応は遅く、2 次速度定数は 10 ⁻²  M ⁻¹ •s ⁻¹程度です。

フォトクリック化学は、光誘起環化反応を利用してN2を放出する_。これにより窒素ガスの損失により短寿命の1,3-ニトリルイミン中間体が生成され、アルケンとの1,3-双極環化付加反応を経てピラゾリン環化付加物を生成する。^[12]

光誘導は、細胞への光損傷を最小限に抑えるために、短時間の光照射（波長はテトラゾールによって異なります）で起こります。反応は水性条件下で促進され、単一の位置異性体を生成します。

過渡的ニトリルイミンは、歪曲エネルギーを低減する曲がった構造のため、1,3-双極子付加環化反応に対して非常に反応性が高い。フェニル環上の電子供与基による置換は、1,3-ニトリルイミン上に配置されたときに HOMO エネルギーを増加させ、反応速度を速める。

このアプローチの利点としては、反応を空間的または時間的に制御できること、遺伝子エンコーディングなどの単純な生物学的方法を使用してアルケンとテトラゾールの両方を生体分子に組み込むことができることなどが挙げられます。^[40]さらに、テトラゾールは反応の進行を監視するために蛍光を発するように設計することができます。^[41]

クアドリシクラン連結反応は、高度に歪んだクアドリシクランを利用してπ系と[2+2+2]環化付加反応を起こす。^[13]

クアドリシクランは非生物的であり、生体分子と反応せず（完全飽和のため）、比較的小さく、非常に歪んでいます（約 80 kcal/mol）。しかし、室温および生理学的 pH の水性条件では非常に安定しています。電子不足の π システムと選択的に反応できますが、単純なアルケン、アルキン、またはシクロオクチンとは反応できません。

反応性に基づく候補スクリーニングから、ビス(ジチオベンジル)ニッケル(II)が反応パートナーとして選択されました。光誘起によるノルボルナジエンへの逆戻りを防ぐため、ジエチルジチオカルバメートを添加して生成物中のニッケルをキレート化します。

これらの反応は水性条件によって促進され、二次速度定数は 0.25 M ⁻¹ •s ⁻¹です。特に興味深いのは、オキシム形成と銅フリークリックケミストリーの両方に対して生体直交性であることが証明されていることです。

バイオオルソゴナル化学は、核イメージングや放射線治療におけるプレターゲティング実験のための魅力的なツールである。^[42]