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核様体（核のような意味）は、原核細胞内にある不規則な形状の領域で、遺伝物質のすべてまたはほとんどが含まれます。[1] [2] [3]典型的な原核生物の染色体は円形で、その長さは細胞の大きさに比べて非常に大きいため、細胞に収まるように圧縮する必要があります。真核細胞の核とは対照的に、核膜に囲まれていません。代わりに、核様体は、染色体構築タンパク質とRNA分子、およびDNAスーパーコイルの助けを借りて、凝縮および機能的配置によって形成されます。ゲノムの長さは大きく異なり（通常、少なくとも数百万塩基対）、細胞にはゲノムの複数のコピーが含まれる場合があります。
細菌の核様体の高解像度構造はまだわかっていないが、モデル生物として大腸菌の主要な特徴が研究されている。大腸菌では、染色体 DNA は平均して負のスーパーコイルをしており、プレクトネミック ループに折り畳まれている。プレクトネミック ループは異なる物理的領域に限定されており、互いに拡散することはめったにない。これらのループは、マクロドメインと呼ばれるメガベース サイズの領域に空間的に整理され、その中で DNA サイトは頻繁に相互作用するが、それらの間での相互作用はまれである。凝縮され空間的に整理された DNA は、細胞内で放射状に閉じ込められたらせん状の楕円体を形成する。核様体内の DNA の 3D 構造は条件によって変化するようで、遺伝子発現にリンクされているため、核様体構造と遺伝子転写は密接に相互依存しており、相互に影響を及ぼし合っている。
背景
多くの細菌では、染色体は共有結合で閉じた（環状の）二本鎖DNA分子で、遺伝情報を半数体形式でコード化しています。DNAのサイズは、生物に応じて500,000から数百万塩基対（bp）までさまざまで、500から数千の遺伝子をコード化しています。[2]染色体DNAは、核様体（核のようなという意味）と呼ばれる非常にコンパクトで組織化された形で細胞内に存在し、真核細胞のように核膜で包まれていません。[6]分離された核様体は、重量で80％のDNA、10％のタンパク質、10％のRNAで構成されています。[7] [8]
グラム陰性細菌である 大腸菌は、染色体DNAが核様体になる仕組み、核様体の形成に関与する因子、核様体構造についてわかっていること、DNA構造が遺伝子発現にどのような影響を与えるかなどを調べる核様体研究のモデル系である。[2] [3]
核様体形成には、大きな DNA を小さな細胞空間に凝縮することと、DNA を三次元形式で機能的に組織化することという 2 つの重要な側面があります。大腸菌の半数体環状染色体は、約 4.6 x 10 6 bp で構成されています。DNA がB 形式で緩和されている場合、円周は約 1.5 ミリメートル (0.332 nm x 4.6 x 10 6 ) になります。ただし、大腸菌染色体 DNAなどの大きな DNA 分子は、懸濁液中でまっすぐな硬い分子のままではありません。[5] ブラウン運動により、DNA に曲率と曲がりが生じます。二重らせん DNA がブラウン運動によって強制される曲がりに抵抗してまっすぐなままである最大の長さは約 50 nm または 150 bp であり、これは持続長と呼ばれます。したがって、純粋な DNA は追加要因がなくても大幅に凝縮され、熱平衡ではランダムコイル形式になります。[4] [5]大腸菌染色体DNAのランダムコイルは、回転半径（R g = (√N a)/√6）から計算すると、約523 μm 3の体積（4/3 π r 3 ）を占めます。ここで、aはキューン長（持続長の2倍）、NはDNA内のキューン長セグメントの数（DNAの全長をaで割ったもの）です。[5] DNAはすでにランダムコイルの形で凝縮されていますが、1ミクロン未満の核様体の体積を想定することはできません。したがって、DNAの固有の特性だけでは不十分であり、追加の要因によって、約10 3（ランダムコイルの体積を核様体の体積で割ったもの）のオーダーでDNAをさらに凝縮する必要があります。 核様体形成の2番目の重要な側面は、DNAの機能的な配置です。染色体DNAは凝縮されているだけでなく、複製、組み換え、分離、転写などのDNA処理プロセスと互換性のある方法で機能的に組織化されています。[9] [10] [11] 1971年からほぼ50年にわたる研究により、[7]核様体の最終形態は、DNAの階層的組織化から生じることが示されています。最小スケール（1 kb以下）では、核様体関連DNA構築タンパク質がDNAを曲げたり、ループさせたり、橋渡ししたり、包んだりすることでDNAを凝縮し、組織化します。より大きなスケール（10 kb以上）では、DNAはプレクトネミックループ、つまりスーパーコイル化によって誘発されるDNAの編みこみ形態を形成します。メガベーススケールでは、プレクトネミックループは6つの空間的に組織化されたドメイン（マクロドメイン）に合体します。これらのドメインは、異なるマクロドメイン間よりも同じマクロドメイン内のDNAサイト間の物理的相互作用がより頻繁に起こることで定義されます。[12]マクロドメイン内およびマクロドメイン間で形成される長距離および短距離のDNA-DNA接続は、凝縮と機能的組織化に寄与します。最終的に、核様体は、縦軸に高度に凝縮されたDNA領域を持つらせん状の楕円体です。 [13] [14] [15]
凝縮と組織化
核様体関連タンパク質（NAP）
真核生物では、ゲノムDNAはヌクレオソームと呼ばれるDNAタンパク質粒子の繰り返し配列の形で凝縮されています。[16] [17] [18]
ヌクレオソームは、ヒストンタンパク質の八量体複合体に巻き付いた約146bpのDNAで構成されています。細菌にはヒストンはありませんが、核様体関連タンパク質（NAP）と呼ばれるDNA結合タンパク質のグループがあり、これは広い意味でヒストンと機能的に類似しています。NAPは非常に豊富で、核様体のタンパク質成分のかなりの割合を構成しています。[19]
NAP の特徴的な特性は、特異的（配列または構造特異的）および非配列特異的の両方の方法で DNA に結合する能力です。その結果、NAP は二重機能タンパク質です。[20] NAP の特異的結合は、主に遺伝子特異的転写、DNA 複製、組み換え、および修復に関与しています。[9] [10] [11]ピーク時には、多くの NAP の分子数はゲノム内の特異的結合部位の数よりも数桁多くなります。[20]したがって、NAP は主に非配列特異的モードで染色体 DNA に結合し、このモードが染色体の圧縮に重要であると考えられます。NAP の非配列特異的結合は完全にランダムではない可能性があり、配列依存の DNA コンフォメーションまたは他の NAP によって作成された DNA コンフォメーションにより、配列特異性および/または構造特異性が低くなる可能性があります。[18]
NAP が体内でDNA を凝縮する分子メカニズムは十分に解明されていないが、広範なin vitro研究に基づくと、NAP は以下のメカニズムを介して染色体の凝縮に関与していると思われる。NAP は DNA の曲がりを誘発して安定化させ、持続長を短縮することでDNA の凝縮を助ける。 [20] NAP は、染色体の近くの DNA セグメント間または離れた DNA セグメント間で発生する可能性のあるブリッジング、ラッピング、およびバンチングによって DNA を凝縮する。NAP が染色体の凝縮に関与するもう 1 つのメカニズムは、 DNA 内の負のスーパーコイルを制限して染色体のトポロジカルな組織化に寄与することです。[20]
大腸菌には少なくとも12種類のNAPが同定されており[20]、その中で最も広く研究されているのはHU、IHF、H-NS、Fisです。それらの存在量とDNA結合特性、DNAの凝縮と組織化への影響は、以下の表にまとめられています。[20]
1存在量（分子/細胞）データは以下から取得されました。[21]括弧内の数字は、次の式を使用して計算されたマイクロモル濃度です：（天然機能単位の数/アボガドロ数）x（1/リットルの細胞容積）x 10 3。リットルの細胞容積（2 x 10 −15 ）は、大腸菌細胞の容積を2μm 3と仮定して決定されました。[21]
1結合親和性は、モル単位（M）での平衡解離定数（Kd）を指します。ND = 未決定
ヒュー
大腸菌U93株由来のヒストン様タンパク質（HU）は、細菌において進化的に保存されたタンパク質である。[33] [34] HUは、大腸菌において、69%のアミノ酸同一性を共有する2つのサブユニットHUαとHUβのホモ二量体およびヘテロ二量体として存在する。[35]ヒストン様タンパク質と呼ばれているが、真核生物におけるHUの近縁機能的類似物は、ヒストンではなく、高移動度群（HMG）タンパク質である。[36] [37] HUは、配列特異的でないDNA結合タンパク質である。あらゆる線状DNAに低親和性で結合する。しかし、構造的に歪んだDNAには高親和性で優先的に結合します。[38] [39] [40] [41] [42] [24]歪んだDNA基質の例には、十字形DNA 、膨らんだDNA、切れ目、ギャップ、フォークなどの一本鎖切断を含むdsDNAが含まれます。さらに、HUはタンパク質媒介DNAループに特異的に結合し、安定化します。[43]構造特異的DNA結合モードでは、HUは歪みによって作成された曲がりやねじれによって定義される共通の構造モチーフを認識します。[22] [44] [23]一方、リン酸骨格をロックすることで線状DNAに結合します。[45]高親和性の構造特異的結合は、部位特異的組換え、DNA修復、DNA複製開始、遺伝子調節などのHUの特殊な機能に必要ですが、[9] [10] [11]低親和性の一般的な結合はDNA凝縮に関与しているようです。[45]クロマチン免疫沈降法とDNAシークエンシング（ChIP-Seq）を組み合わせた解析では、HUは特異的な結合イベントを示さない。[46]代わりに、HUはゲノム全体にわたって均一な結合を示し、おそらくそのほとんどが弱い非配列特異的結合を反映しており、生体内での高親和性結合を隠していると考えられる。[46]
HUを欠く株では、核様体は「脱凝縮」され、これはDNAの凝縮におけるHUの役割と一致している。[47]以下の試験管内研究は、HUが生体内でDNAを凝縮および組織化する可能性のあるメカニズムを示唆している。HUは曲がった歪んだDNAに安定的に結合するだけでなく、100nM未満の濃度でも線状DNAに柔軟な曲がりを誘発する。対照的に、HUは生理学的に関連するより高い濃度ではDNAに対して逆の構造効果を示す。[45] [9] [10] [11] [47] [48] HUは硬い核タンパク質フィラメントを形成し、DNAを曲げるのではなく直線化させる。フィラメントはさらに、配列非特異的なDNA結合によって引き起こされるHU-HU多量体化により、横方向と内側の両方に拡張可能なDNAネットワーク（DNAバンチング）を形成できる。[45]
HUのこれらの挙動は細胞内でどのように関連しているのでしょうか？フィラメントの形成には、DNA上のHUの高密度結合、つまり9〜20 bpのDNAあたり1つのHU二量体が必要です。しかし、細胞あたりのHU二量体の推定存在量が30,000個（4600000 bp /30,000）であることに基づくと、染色体DNAの約150 bpごとに1つのHU二量体しかありません。[21]これは、柔軟な曲がりが生体内で発生する可能性が高いことを示しています。磁気ピンセット実験で示されているように、柔軟な曲がりはDNAの持続長の減少による凝縮を引き起こし、DNA結合タンパク質による単一のDNA分子の凝縮を研究することができます。[48] [49]しかし、協同性のために、染色体のいくつかの領域で硬いフィラメントとネットワークが形成される可能性があります。フィラメント形成だけでは凝縮は引き起こされないが[48]、DNAのネットワーク化や束化は、離れた染色体セグメントや近くの染色体セグメントを一緒にすることで凝縮に大きく寄与する可能性がある[45] 。
国際高周波
統合宿主因子（IHF）は、構造的にはHUとほぼ同一である[51]が、多くの点でHUとは異なった挙動を示す。配列に関係なく構造モチーフに優先的に結合するHUとは異なり、IHFは、配列依存のDNA構造と変形可能性によって特異性が生じるにもかかわらず、特定のDNA配列に優先的に結合します。同族部位でのIHFの特異的結合により、DNAは160度以上急激に曲がります。[51]同族配列モチーフは、大腸菌ゲノム中に約3000個出現します。[46]増殖期におけるIHFの推定存在量は、細胞あたり約6000個の二量体です。指数関数的増殖期に1つのIHF二量体が1つのモチーフに結合し、核様体にゲノム相当物が1つ以上含まれると仮定すると、ほとんどのIHF分子はゲノム内の特定の部位を占有し、急激な曲がりを誘発することによってのみDNAを凝縮すると考えられます。[46]
特定の DNA 配列への優先的な結合に加えて、IHF は HU と同様の親和性で非配列特異的な方法で DNA に結合します。IHF の非特異的結合の DNA 凝縮における役割は、IHF の存在量が定常期に 5 倍に増加し、追加の IHF 二量体が染色体 DNA に非特異的に結合する可能性が高いため、定常期に重要であると思われます。[21] [52] [53] HU とは異なり、IHF は高濃度で太くて硬いフィラメントを形成しません。代わりに、その非特異的結合も DNA の曲がりを引き起こしますが、曲がりの程度は特定のサイトでの曲がりの程度よりもはるかに小さく、低濃度で HU によって線状 DNA に誘導される柔軟な曲がりに似ています。[54] 試験管内では、IHF の非特異的結合によって誘導される曲がりは DNA 凝縮を引き起こし、塩化カリウムと塩化マグネシウムの濃度に応じて高次核タンパク質複合体の形成を促進します。[54]生体内でのIHFによる高次DNA組織化はまだ明らかになっていない。[54]
H-NS
ヒストン様または熱安定性核様体構造タンパク質（H-NS）[55] [56] [57] [58]と他のNAPとの際立った特徴は、比較的低濃度（< 1 x 10 −5 M）でのホモ二量体形態から、高濃度でのオリゴマー状態に切り替える能力である。[59] [60]オリゴマー化特性のため、H-NSは核形成反応においてATに富むDNAに沿って横方向に広がり、高親和性部位が核形成中心として機能する。[61] [62] [28] DNA上でのH-NSの広がりは、反応中のマグネシウム濃度に応じて2つの相反する結果をもたらす。低マグネシウム濃度（< 2 mM）では、H-NSは剛性の核タンパク質フィラメントを形成するのに対し、高マグネシウム濃度（> 5 mM）では分子間および分子内のブリッジを形成する。[63] [64] [65] [66] [67]剛性フィラメントの形成は、凝縮することなくDNAを真っ直ぐにするが、架橋は大幅なDNAの折り畳みを引き起こす。[66] ChIP-Seqアッセイによるゲノム内のH-NS結合の分析は、生体内でのDNA上のH-NSの拡散の間接的な証拠を提供した。 H-NSはゲノム内の458の領域に選択的に結合します。[50] H-NSはDNA配列中の反復Aトラックによって形成される湾曲したDNAを好むことが実証されているが[61] [68] 、選択的結合の根拠はATに富む領域に見られる保存された配列モチーフの存在である。[27]さらに重要なことは、協調的なタンパク質間相互作用を強化できるH-NS結合領域内の配列モチーフの頻繁な出現と、結合領域の異常に長い長さが、タンパク質の拡散と一致している。生体内でフィラメント形成またはDNA架橋のどちらが優勢であるかは、細胞内のマグネシウムの生理的濃度に依存する。[66] [69]マグネシウム濃度が均一に低い場合（< 5 mM）、H-NSは生体内で硬い核タンパク質フィラメントを形成する。[66]一方、細胞内でマグネシウムが不均一に分布している場合は、核様体の異なる領域でDNA架橋と硬化の両方が促進される可能性がある。[66]
さらに、H-NSは、水平伝播した遺伝子の転写を優先的に阻害するグローバル遺伝子サイレンサーとして最もよく知られており、遺伝子サイレンシングにつながるのは剛性フィラメントです。[70] [71]総合すると、剛性フィラメントの形成は、遺伝子サイレンシングにつながるがDNA凝縮は引き起こさない、生体内でのH-NS-DNA相互作用の最も可能性の高い結果であると思われます。一貫して、H-NSが欠如していても核様体の体積は変化しません。[72]しかし、大腸菌は、環境条件下で高マグネシウム濃度を経験する可能性があります。そのような条件では、H-NSは、フィラメント誘導型からDNA凝縮と組織化に寄与するブリッジ誘導型に切り替わります。[66]
フィス
反転刺激因子（Fis）は、15bpの対称モチーフを含む特定のDNA配列に結合する配列特異的DNA結合タンパク質である。[29] [30] [73] IHFと同様に、Fisは同族部位でDNAの曲げを誘導する。DNAを曲げる能力は、Fisホモ二量体の構造に明らかである。Fisホモ二量体は、各モノマーから1つずつ、2つのヘリックスターンヘリックス（HTH）モチーフを有する。HTHモチーフは通常、DNA主溝を認識する。しかし、Fisホモ二量体中の2つのHTHモチーフのDNA認識ヘリックス間の距離は25Åで、これは標準的なB-DNAのピッチよりも約8Å短い。これは、タンパク質が安定して結合するためにはDNAを曲げたりねじったりしなければならないことを示している。[74] [75]一貫して、 Fis-DNA複合体の結晶構造は、認識ヘリックス間の距離は変化しないが、DNAは60〜75度の範囲で曲がることを示している。[30]大腸菌ゲノムには1464のFis結合領域が分布しており、計算によって特定された結合モチーフは、既知の15bpモチーフと一致している。[50] [76]このような部位でのFisの特異的結合はDNAの曲がりを誘発し、DNAの持続長を短縮することでDNA凝縮に寄与する。さらに、多くのFis結合部位は、安定したRNAプロモーター、例えばrRNAオペロンrrnBのP1プロモーター内のもののように、直列に発生する。直列部位でのFisによる一貫した曲がりは、DNA凝縮にさらに寄与する可能性のあるDNAマイクロループを作成する可能性が高い。[77]
同族部位への高親和性特異的結合の他に、FisはランダムなDNA配列に結合することができる。成長期にはFisがHUと同じくらい豊富に存在するため、非特異的DNA結合は重要である。したがって、ほとんどのFis分子は非配列特異的な方法でDNAに結合すると予想される。磁気ピンセット実験は、Fisのこの非特異的結合がDNAの凝縮と組織化に寄与できることを示している。[78] [79] Fisは1 mM未満では単一のDNA分子の軽度の凝縮を引き起こすが、1 mMを超えると平均サイズが約800 bpのDNAループの形成を通じて大幅な折り畳みを誘導する。磁気ピンセット実験におけるループは、同族部位での一貫したDNAの曲げによって作成されるマイクロループとは異なり、配列に依存しない結合によって達成される高密度DNA-タンパク質複合体の形成を必要とする。生体内でのこのようなループの発生はまだ実証されていないが、特異的結合と非特異的結合の両方の協調作用により、生体内でのFis の高密度結合が発生する可能性がある。特異的部位の同時発生により、H-NS と同様の核形成反応が開始され、その後、非特異的結合により局所的な高密度 Fis 配列が形成される可能性がある。これらの局所領域間の架橋により、大きな DNA ループが形成される可能性がある。[79] Fis は成長期にのみ存在し、定常期には存在しない。[80] [81]したがって、染色体凝縮における Fis の役割は、成長中の細胞に特異的であるに違いない。[81]
核様体関連RNA（naRNA）
単離された核様体に対するRNase A処理の効果を調べた初期の研究では、RNAが凝縮状態の核様体の安定化に関与していることが示されました。[82]さらに、RNase A処理によりDNA繊維がより細い繊維に破壊され、それが「基質上溶解法」を用いた核様体の原子間力顕微鏡検査で観察されました。[83]これらの知見はRNAが核様体構造に関与していることを実証しましたが、RNA分子の正体は最近まで不明でした。[47] HUに関する研究のほとんどは、そのDNA結合に焦点を当てていました。[83]しかし、HUはdsRNAおよびRNA-DNAハイブリッドにも、線状dsDNAと同様の低い親和性で結合します。[84]さらに、HUは二次構造を含むRNA、およびRNAにニックまたはオーバーハングが含まれるRNA-DNAハイブリッドに優先的に結合します。[84] [85] HUとこれらのRNA基質との結合親和性は、歪んだDNAに結合する親和性と類似している。HU結合RNAの免疫沈降と逆転写マイクロアレイ（RIP-Chip）研究を組み合わせたものや、精製された完全な核様体からのRNAの分析により、HUと相互作用する核様体関連RNA分子が同定された。[47]それらのいくつかは非コードRNAであり、そのうちの1つであるnaRNA4（核様体関連RNA 4）は、反復性外遺伝子回文（REP325 ）にコードされている。 REP325を欠損した株では、HUを欠損した株と同様に核様体が脱凝縮される。[47] naRNA4は、HUの存在下でDNAセグメントを接続することにより、DNA凝縮に関与している可能性が高い。[86]最近の研究では、naRNA4がDNA-DNA接続を確立する分子メカニズムに関する洞察が得られている。 RNAは十字形構造を含むDNA領域を標的とし、DNA-DNA結合を確立するために重要なRNA-DNA複合体を形成する。[87]驚くべきことに、HUは複合体の形成を助けるが、最終的な複合体には存在しないため、触媒（シャペロン）としての役割を果たす可能性がある。RNA-DNA複合体の性質は依然として謎に包まれている。複合体の形成には広範なワトソン/クリック塩基対形成は関与せず、RNA-DNAハイブリッド内のRNAを切断するRNase Hに敏感であり、複合体はRNA-DNAハイブリッドに特異的な抗体に結合するからである。[47] [83] [84]
スーパーコイル
二本鎖DNA分子はらせん構造のため、自由端の回転を排除した共有結合で閉じた環状の形で位相的に制約される。 [88]位相的に制約されたDNAで2本の鎖が交差する回数は結合数（Lk）と呼ばれ、環状分子のらせんの回転数またはねじれ数に等しい。[89]位相的DNAのLkは、DNA分子がどのように変形しても、どちらの鎖も切断されない限り不変である。[90] [91]
緩和型DNAのLkはLk 0と定義される。どのDNAでも、Lk 0 はDNAの長さ（bp）をらせん1回転あたりのbp数で割ることで計算できる。緩和型B型DNAの場合、これは10.4 bpに等しい。Lk 0からの偏差はDNAのスーパーコイル化を引き起こす。連結数が減少すると（Lk<Lk 0）、負のスーパーコイル化が生じ、連結数が増加すると（Lk>Lk 0）、正のスーパーコイル化が生じる。[92] [90]
スーパーコイル状態（LkがLk 0と等しくない場合）では、DNA構造が変化し、ねじれの数の変化（負：10.4 bp/ターン未満、正：10.4 bp/ターン超）や、スーパーコイルと呼ばれるねじれの形成として現れることがあります。したがって、Lkは、ねじれとねじれという2つの幾何学的パラメータの符号依存の合計として数学的に定義されます。DNA分子のサイズに依存しないスーパーコイルの定量的な尺度は、スーパーコイル密度（σ）であり、σ =∆Lk/Lk 0です。[91]
ねじれは、プレクトンとソレノイドまたはトロイドの 2 つの構造をとることができます。プレクトン構造は、らせん軸の絡み合いから生じます。トロイド状スーパーコイルは、電話コードのように、DNA が軸の周りを互いに交差せずに複数のらせんを形成するときに発生します。[90]プレクトン形態のねじれは、正または負のスーパーコイル DNA ではそれぞれ右巻きと左巻きです。トロイド状スーパーコイルの利き手は、プレクトンとは反対です。プレクトンとトロイド状スーパーコイルはどちらも、自由な形式か、タンパク質に結合した形で拘束されています。生物学における結合トロイド状スーパーコイルの最良の例は、 DNA がヒストンに巻き付く真核生物のヌクレオソームです。[17]
プレクトネミックスーパーコイル大腸菌
ほとんどの細菌では、DNAはスーパーコイルの形で存在します。大腸菌の染色体は環状であるため、トポロジー的に制約された分子であり、大部分は負のスーパーコイルになっており、平均スーパーコイル密度（σ）は-0.05と推定されています。[93]真核生物のクロマチンでは、DNAは主にトロイダル型で存在し、ヒストンによってヌクレオソームの形成によって拘束され定義されます。対照的に、大腸菌の核様体では、染色体DNAの約半分が自由なプレクトン超コイルの形で組織化されています。[94] [95] [96]残りのDNAは、NAPなどのタンパク質との相互作用により、プレクトン型またはトロイダル型に限定されない代替形式のいずれかで拘束されます。したがって、プレクトン超コイルは、大腸菌ゲノムの凝縮と組織化を担う効果的なスーパーコイルを表しています。プレクトネミックおよびトロイダルスーパーコイルはどちらも DNA の凝縮を助けます。プレクトネミック構造の分岐はトロイダル構造よりも DNA の凝縮が少なくなります。同じサイズの DNA 分子でスーパーコイル密度が等しい場合、トロイダル形態のほうがプレクトネミック形態よりもコンパクトになります。スーパーコイルは DNA の凝縮に加えて DNA の組織化を助けます。連鎖形成の可能性を減らすことで DNA の絡み合いを解きほぐします。[97]スーパーコイルは DNA の離れた 2 つの部位を近づけるのにも役立ち、それによって DNA の異なるセグメント間の潜在的な機能的相互作用を促進します。[91]
スーパーコイルの発生源大腸菌
大腸菌における染色体DNAのスーパーコイルの生成と維持には、(i)トポイソメラーゼの活性、(ii)転写作用、(iii)NAPの3つの因子が寄与している。[95]
トポイソメラーゼ
トポイソメラーゼはDNA代謝酵素の特別なカテゴリーであり、DNA鎖を切断して再連結することでスーパーコイルを生成または除去する。[98] 大腸菌は4つのトポイソメラーゼを有する。DNAジャイレースはATP存在下で負のスーパーコイルを導入し、ATP不在下では正のスーパーコイルを除去する。[99]すべての生命体の中で、DNAジャイレースは負のスーパーコイルを生成できる唯一のトポイソメラーゼであり、このユニークな能力のために細菌ゲノムは自由な負のスーパーコイルを有する。DNAジャイレースはすべての細菌に見られるが、高等真核生物には存在しない。対照的に、トポIは負のスーパーコイルDNAを緩和することでDNAジャイレースに対抗する。[100] [101] DNAジャイレースとトポIの相反する活動のバランスが、大腸菌における平均負の超らせんの定常レベルを維持していることを示唆する遺伝学的証拠がある。[100] [102]両方の酵素は大腸菌の生存に不可欠である。トポIをコードする遺伝子であるtopAのヌル株は、DNAジャイレースをコードする遺伝子に抑制変異が存在するためにのみ生き残る。[100] [102 ]これらの変異はジャイレース活性を低下させ、トポIの欠如による過剰な負の超らせんがDNAジャイレースの負の超らせん活性の低下によって補われることを示唆している。トポIIIは大腸菌では不要であり、大腸菌での超らせん形成に何らかの役割を果たすことは知られていない。 [103]トポIVの主な機能は姉妹染色体を分解することである。しかし、トポIとともに負の超らせん構造を緩和することで、負の超らせん構造の定常レベルにも寄与することが示されている。[104] [105]
転写
Liu と Wang によって提唱されたツインスーパーコイルドメインモデルは、転写中にDNA 二重らせんがほどけることで、図に示すように DNA にスーパーコイルが形成されると主張しました。[106]彼らのモデルによると、転写中のRNA ポリメラーゼ(RNAP) が DNA に沿ってスライドすると、DNA がらせん軸を中心に回転します。DNA の自由回転の妨げは、位相制約によって発生する可能性があり、RNAP の前の DNA は過度にねじれ (正のスーパーコイル)、RNAP の後ろの DNA はねじれが不足 (負のスーパーコイル) します。RNAP は線形 DNA テンプレートでもスーパーコイルを形成するのに十分なトルクを生成するため、位相制約は必要ないことが判明しています。[107] DNA がすでに負のスーパーコイルになっている場合、この作用により、既存の負のスーパーコイルが緩和されてから、RNAP の前にある正のスーパーコイルが蓄積され、RNAP の後ろにさらに負のスーパーコイルが導入されます。原理的には、DNAジャイレースとトポIはそれぞれ余分な正と負のスーパーコイルを除去するはずですが、RNAPの伸長速度が2つの酵素のターンオーバーを超えると、転写がスーパーコイルの定常レベルに寄与します。[107]
NAPによる超らせん構造の制御
真核生物のクロマチンでは、DNAが自由な超らせん構造で存在するのはまれである。これは、DNAがヒストンにしっかりと結合してヌクレオソームが負の超らせん構造をほぼすべて抑制するためである。同様に、大腸菌では、NAPによって形成される核タンパク質複合体が、核様体の超らせん構造密度の半分を抑制している。[93] [96]言い換えれば、NAPが核タンパク質複合体から解離すると、DNAは自由なプレクトン形態をとる。HU、Fis、およびH-NSのDNA結合は、緩んでいるが位相的に制約のあるDNAにおいて負の超らせん構造を抑制することが実験的に示されている。[108] [109] [110] [111] [112]これらは、DNAのらせんピッチを変えるか、DNAを曲げたり巻いたりしてトロイダルなねじれを生成することで、これを実行できる。あるいは、NAPは十字形構造や分岐プレクトネムなどの他の形態のDNAに優先的に結合して安定化することができる。Fisは交差領域への結合を通じて分岐プレクトネムを組織化することが報告されており、HUは十字形構造に優先的に結合する。[112]
NAP は間接的に DNA のスーパーコイル形成も制御します。Fis は DNA ジャイレースをコードする遺伝子の転写を抑制することでスーパーコイル形成を調節することができます。[113] HU がDNA ジャイレースを刺激し Topo I の活性を低下させることでスーパーコイル形成レベルを制御することを示唆する遺伝学的証拠があります。 [114] [115]遺伝学的研究を裏付けるように、HU は試験管内でDNA ジャイレースが触媒する DNA の脱連鎖化を刺激することが示されました。[116] HU がジャイレースと Topo I の活性を調節するメカニズムは不明です。HU は DNA ジャイレースと Topo I と物理的に相互作用するか、DNA 曲げなどの HU の DNA 組織化活動がそれぞれ DNA ジャイレースと Topo I の作用を促進または阻害する可能性があります。[114] [116]
プレクトネミックスーパーコイルは複数のトポロジカルドメインに組織化される
核様体の顕著な特徴の 1 つは、プレクトネミック スーパーコイルが複数のトポロジカル ドメインに編成されていることです。[117]言い換えると、1 つのドメインを 1 回切断すると、そのドメインのみが緩和され、他のドメインは緩和されません。トポロジカル ドメインは、スーパーコイル拡散障壁によって形成されます。異なる方法を採用した独立した研究では、トポロジカル ドメインのサイズは 10 kb から 400 kb の範囲で変化すると報告されています。[95] [117] [118]これらの研究で一般的に観察される障壁のランダムな配置は、ドメインのサイズの幅広い変動を説明しているようです。[117]
ドメインバリアの正体はまだ明らかにされていないが、バリアの形成に関与する可能性のあるメカニズムには以下が含まれる。(i) ドメインバリアは、スーパーコイルを抑制する能力を持つタンパク質が染色体上の2つの異なる部位に同時に結合して、トポロジカルに分離されたDNAループまたはドメインを形成する場合に形成される可能性がある。スーパーコイルDNAにおけるタンパク質媒介ループによってトポロジカルドメインを形成できることは実験的に実証されている。[119] [120] H-NSやFisなどのNAPは、DNAループ能力と結合部位の分布に基づいて、潜在的な候補である。(ii) 細菌散在モザイク要素（BIME）もドメインバリアの潜在的な候補であると思われる。BIMEは、通常、遺伝子間に見られる回文反復配列である。BIMEは、大腸菌染色体に挿入された合成設計されたトポロジカルカセット内でスーパーコイルの拡散を阻害することが示されている。[121]ゲノム全体に約600個のBIMEが分布しており、染色体を600個のトポロジカルドメインに分割している可能性がある。[122] (iii) バリアは、DNAと膜の両方に結合するタンパク質を介してDNAが細胞膜に付着することや、新生転写および膜アンカータンパク質の翻訳によっても生じる可能性がある。 (iv) 転写活性はスーパーコイル拡散バリアを生成する可能性がある。活発に転写されているRNAPは、プレクトネミックスーパーコイルの消散をブロックし、スーパーコイル拡散バリアを形成することがわかっている。[123] [124] [125]
成長段階に依存する核様体のダイナミクス
核様体は定常期細胞で再編成され、これは核様体構造が細胞の生理学的状態によって決定される高度に動的であることを示唆している。核様体の高解像度接触マップの比較により、成長期と比較して定常期にTerマクロドメインの長距離接触が増加することが明らかになった。[126]さらに、定常期のCID境界は成長期に見られるものとは異なっていた。最後に、核様体の形態は長期の定常期中に大規模な変化を遂げる。[127]核様体は整然としたトロイダル構造を示す。[128]
成長期特有の核様体構造の変化は、核様体関連 DNA 構築タンパク質 (NAP および Muk サブユニット)、スーパーコイル、および転写活性のレベルの変化によって引き起こされる可能性があります。NAP と Muk サブユニットの存在量は、細菌の成長サイクルに応じて変化します。Fis と、別の NAP である飢餓誘導 DNA 結合タンパク質 Dps は、それぞれ成長期と定常期にほぼ独占的に存在します。Fis レベルは指数関数的段階に入ると上昇し、その後、細胞がまだ指数関数的段階にある間に急速に低下し、定常期では検出できないレベルに達します。[129] Fis レベルが低下し始める一方で、Dps レベルは上昇し始め、定常期に最大に達します。[21]長期の定常期に観察される核様体構造の劇的な変化は、主に Dps によるものとされています。Dps は DNA/結晶アセンブリを形成し、飢餓中に存在する DNA 損傷因子から核様体を保護する役割を果たします。[128]
HU、IHF、およびH-NSは、増殖期と定常期の両方に存在します。[21]しかし、それらの存在量は大幅に変化し、増殖期にはHUとFisが最も豊富なNAPであるのに対し、定常期にはIHFとDpsが最も豊富なNAPになります。[21] HUααは初期の指数関数的段階の主な形態ですが、定常期にはヘテロ二量体形態が優勢で、ホモ二量体は少量です。[130]この遷移は核様体構造に関して機能的な結果をもたらします。なぜなら、2つの形態はDNAを異なる方法で組織化し、凝縮するように見えるからです。ホモ二量体とヘテロ二量体はどちらもフィラメントを形成しますが、ホモ二量体だけが複数のDNAセグメントをまとめてDNAネットワークを形成できます。[45] MukBのコピー数は定常期に2倍に増加します。[131] [ 132] MukB分子の数の増加は、DNAループ押し出し因子としてのMukBEF複合体のプロセッシング性に影響を与え、ループの増大やループ数の増加をもたらす可能性がある。[131] [132]
スーパーコイルはDNA構築タンパク質と協調して作用し、核様体を再編成する。全体的なスーパーコイルレベルは定常期に低下し、スーパーコイルは領域レベルで異なるパターンを示す。[133]スーパーコイルの変化は核様体の位相的構成を変える可能性がある。さらに、転写活性の高い染色体領域はCID境界を形成するため、異なる成長期における転写活性の変化はCID境界の形成を変え、核様体の空間的構成を変える可能性がある。定常期に観察されるCID境界の変化は、成長期と比較して定常期における異なる遺伝子セットの高発現による可能性がある。[126]
核様体構造と遺伝子発現
NAPと遺伝子発現
大腸菌の染色体構造と遺伝子発現は相互に影響し合っているようだ。一方では、CID境界と高い転写活性の相関は、染色体構成が転写によって駆動されることを示している。他方では、あらゆるスケールでの核様体内のDNAの3D構造が遺伝子発現にリンクしている可能性がある。まず、大腸菌の核様体の3D構造の再編成が細胞の転写パターンを動的に調整できることが示されている。[134] HUaの変異体は、染色体DNAの正の超らせん構造の増加によって核様体が非常に凝縮した。その結果、多くの遺伝子が抑制され、多くの静止遺伝子が発現した。さらに、タンパク質を介した局所的な構造変化が遺伝子転写を変える特定のケースが多数ある。例えば、H-NSによる硬い核タンパク質フィラメントの形成は、RNAPのプロモーターへのアクセスをブロックし、遺伝子転写を防ぐ。[135]遺伝子サイレンシングを通じて、H-NSは、水平伝播した遺伝子の転写を優先的に阻害するグローバルリプレッサーとして機能します。[ 50] [27]別の例では、HUがgalオペロンに特異的に結合すると、誘導因子が存在しない場合でもgalオペロンを抑制したままにするDNAループの形成が促進されます。 [136]安定したRNAプロモーターでのFisによるDNAの一貫した曲げによって作成されたトポロジー的に異なるDNAマイクロループが転写を活性化します。[77] IHFによるDNAの曲げは、大腸菌のilvGMEDAオペロンの2つのタンデムプロモーターからの転写を差別的に制御します。[137] [138] NAPによる特定のトポロジー変化は、遺伝子転写を制御するだけでなく、DNA複製の開始、組み換え、転座などの他のプロセスにも関与しています。[9] [10] [11]特定の遺伝子制御とは対照的に、高次染色体構造とそのダイナミクスが分子レベルで遺伝子発現に全体的にどのように影響するかはまだ解明されていない。[139]
DNAのスーパーコイルと遺伝子発現
DNAスーパーコイルと遺伝子転写の間には双方向の相互関連性が存在する。[139]プロモーター領域の負のスーパーコイルは、プロモーターの融解を促進し、タンパク質調節因子のDNA結合親和性を高めることで転写を刺激することができる。転写の確率的バーストは、高度に発現した遺伝子の一般的な特徴であるようであり、DNAテンプレートのスーパーコイルレベルは転写バーストに寄与する。[140]双子スーパーコイルドメインモデルによれば、遺伝子の転写は、スーパーコイルリレーを介して他の近くの遺伝子の転写に影響を与えることができる。その一例は、leu-500プロモーターの活性化である。[139]スーパーコイルは、遺伝子特異的な変化を媒介するだけでなく、遺伝子発現の大規模な変化も媒介する。核様体のトポロジカル組織化により、異なるトポロジカルドメインでのスーパーコイル感受性遺伝子の独立した発現が可能になる可能性がある。ゲノム規模の非拘束スーパーコイル構造マップでは、ゲノム領域ごとに定常スーパーコイル構造の密度が異なり、スーパーコイル構造のレベルが個々のトポロジカルドメインで異なることが示された。[133]その結果、スーパーコイル構造の変化は、各ドメインのスーパーコイル構造のレベルに応じて、ドメイン特異的な遺伝子発現をもたらす可能性がある。[133]
遺伝子発現に対するスーパーコイル化の効果は、スーパーコイル化に直接的または間接的に影響を及ぼすNAPによって媒介される可能性がある。HUの遺伝子発現に対する効果は、スーパーコイル化の変化とおそらくはDNAの高次構造に関係していると思われる。DNAジャイレース結合とHUの不在によって引き起こされる遺伝子の上方制御との間の正の相関は、スーパーコイル化の変化が差次的発現の原因であることを示唆している。HUはまた、転写誘導性スーパーコイル化を制限することによって転写単位を絶縁することにより、遺伝子発現に対する位置的効果に関与していることがわかった。[141] HUaの点突然変異は大腸菌の遺伝子発現プロファイルを劇的に変え、その形態、生理機能、代謝を変えた。その結果、変異株は哺乳類細胞への侵入性が高まった。[134] [142]この劇的な効果は、核様体の圧縮と正のスーパーコイル化の増加と同時に起こった。[45] [143]変異タンパク質は、野生型の二量体とは対照的に、八量体であった。野生型のHUとは対照的に、DNAを右巻きに表面に巻き付け、正のスーパーコイルを抑制している。[143]これらの研究は、HUのアミノ酸置換が核様体構造に劇的な影響を及ぼし、その結果、顕著な表現型の変化をもたらすことを示している。[143]
MukBとHUは長距離DNA相互作用において重要な役割を果たしていることが分かってきたため、これら2つのタンパク質が遺伝子発現全体に及ぼす影響を比較することは価値があるだろう。[144] HUはスーパーコイル密度を調節することで遺伝子発現を制御しているように見えるが、正確な分子メカニズムは不明であり、MukBが遺伝子発現に与える影響はまだ分析されていない。[144] [145]
空間構成
染色体相互作用ドメイン
近年、染色体コンフォメーションキャプチャー（3C）と呼ばれる分子的方法の出現により、細菌と真核生物の両方で染色体の高解像度の空間構成を研究できるようになった。[146] 3Cとディープシーケンシング（Hi-C）を組み合わせたバージョン[147]は、3D空間内の任意の2つのゲノム遺伝子座間の物理的な近接性（もしあれば）を決定する。大腸菌染色体を含む細菌染色体の高解像度接触マップは、細菌染色体が染色体相互作用ドメイン（CID）と呼ばれる多くの高度に自己相互作用する領域に分割されていることを明らかにした。[126] [148] [149] CIDは、多くの真核生物染色体で観察されるトポロジカル関連ドメイン（TAD）に相当し、 [150] CIDの形成はゲノム構成の一般的な現象であることを示唆している。2つの特性がCIDまたはTADを定義する。第一に、CIDのゲノム領域は、そのCIDの外側のゲノム領域や隣接するCIDのゲノム領域よりも、互いに物理的に相互作用する頻度が高い。第二に、CID間に境界が存在するため、隣接する2つのCIDのゲノム領域間の物理的相互作用が妨げられる。[126]
大腸菌の染色体は、増殖期に 31 個の CID から構成されることがわかった。CID のサイズは 40 kb から約 300 kb に及んだ。プレクトン DNA ループをトポロジカルドメインに分離する役割を担うスーパーコイル拡散障壁が、大腸菌や他の多くの細菌における CID 境界として機能しているようだ。言い換えれば、スーパーコイル拡散障壁の存在が CID の形成を定義する。大腸菌、Caulobacter crescentus、およびBacillus subtilisの染色体の Hi-C プロービングから得られた知見は、プレクトンループと NAP の DNA 組織化活性がゲノム遺伝子座間の物理的相互作用を促進するために CID が形成され、CID 境界はこれらの相互作用を防ぐプレクトンフリー領域 (PFR) で構成されるというモデルに収束している。 PFR は、活発に転写される RNAP による DNA のらせん状の巻き戻しがプレクトネミック スーパーコイルを抑制するため、高い転写活性によって生成されます。その結果、スーパーコイルの消散もブロックされ、スーパーコイル拡散障壁が形成されます。このモデルの間接的な証拠は、大腸菌染色体を含む細菌染色体の CID が、その境界に高度に転写された遺伝子を表示するという観察から得られ、 CID 境界の形成における転写の役割を示しています。[126] [148]より直接的な証拠は、境界が存在しない位置に高度に転写された遺伝子を配置すると、C. crescentus染色体に新しい CID 境界が作成されたという発見から得られました。[148]ただし、すべての CID 境界が大腸菌染色体の高度に転写された遺伝子と相関しているわけではなく、他の未知の要因も CID 境界とスーパーコイル拡散障壁の形成に関与していることを示唆しています。[148]
マクロドメイン
トポロジカルドメインまたはCIDとして組織化されたプレクトンDNAループは、さらに合体して、マクロドメイン（MD）と呼ばれる空間的に異なる大きなドメインを形成するようです。大腸菌では、 MDは当初、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）研究でDNAマーカーが一緒に局在する（共局在する）ゲノムの大きなセグメントとして特定されました。 [151] [152] oriC （染色体複製起点）遺伝子座をカバーする大きなゲノム領域（約1 Mb）が共局在し、Oriマクロドメインと呼ばれました。同様に、複製終結領域（ter ）をカバーする大きなゲノム領域（約1 Mb）が共局在し、Terマクロドメインと呼ばれました。MDは後に、染色体のさまざまな離れた場所に挿入されたラムダattサイトのペアが互いに再結合する頻度に基づいて特定されました。この組み換えに基づく方法では、MDは、DNA部位が主に互いに組み換えられるが、そのMDの外側の部位とは組み換えられない大きなゲノム領域として定義されました。組み換えに基づく方法により、FISH研究で特定されたOriおよびTer MDが確認され、さらに2つのMDが特定されました。[12] [153]
2 つの追加の MD は、Ter を挟む追加の約 1 Mb の領域によって形成され、Left と Right と呼ばれていました。これらの 4 つの MD (Ori、Ter、Left、Right) は、Ori を挟む 2 つのゲノム領域を除いて、ゲノムの大部分を構成していました。これらの 2 つの領域 (NS-L と NS-R) は、その中の DNA サイトが両側の MD にある DNA サイトと再結合するため、MD に比べて柔軟で非構造化されていました。oriC の遺伝子位置はMDの形成を決定しているようで、遺伝子操作によるoriCの再配置はMD の再編成をもたらします。たとえば、oriCに最も近いゲノム領域は、DNA 配列に関係なく常に NS として動作し、離れた領域は常に MD として動作します。[154]
Hi-C技術により、マクロドメインの形でのCIDの階層的な空間組織がさらに確認されました。[126]言い換えれば、マクロドメインのCIDは、隣接するマクロドメインのCIDまたはそのマクロドメイン外のゲノム座位よりも、互いに物理的に相互作用する頻度が高かったのです。Hi-Cデータは、大腸菌染色体が2つの異なるドメインに分割されていることを示しました。terを囲む領域は、以前に特定されたTer MDと重複する絶縁ドメインを形成しました。このドメインでのDNA-DNA接触は、最大約280 kbの範囲でのみ発生しました。染色体の残りの部分は、ゲノム座位が> 280-kbの範囲で接触を示した単一のドメインを形成しました。[126]このドメインでの接触のほとんどは最大距離が約500 kbに制限されていましたが、ゲノム座位がさらに遠い距離（最大約1 Mb）で接触を形成する緩い領域が2つありました。これらの緩い領域は、以前に特定された柔軟で構造化されていない領域（NS）に対応していました。terを囲む絶縁ドメインとHi-C法によって特定された2つの緩い領域の境界は、染色体全体を、組み換えベースのアッセイによって定義された4つのMDと2つのNS領域に対応する6つの領域に分割しました。[126]
マクロドメイン形成を促進するタンパク質
マットP
マクロドメイン形成に関与するタンパク質の探索により、マクロドメイン Ter タンパク質 (MatP) が同定されました。MatP は、マクロドメインter配列 ( matS )と呼ばれる 13 bp のモチーフを認識することで、Ter MD にほぼ独占的に結合します。 [32] Ter ドメインには 23 個のmatSサイトがあり、平均して 35 kb ごとに 1 つのサイトがあります。MatP が Ter ドメインに結合するさらなる証拠は、MatP の蛍光イメージングから得られます。Ter ドメイン DNA マーカーと共局在する個別の MatP フォーカスが観察されました。[32] Ter MD でのChIP-Seqシグナルの強力な濃縮も、このドメインへの MatP の優先的な結合を裏付けています。[32]
MatP が Ter ドメインで DNA を凝縮するのは、MatP がないと Ter ドメイン内で 100 kb 離れた 2 つの蛍光 DNA マーカー間の距離が広がったためである。さらに、MatP は Ter ドメインを染色体の残りの部分から絶縁する上で重要な役割を果たしている。[126] MatP は Ter ドメイン内での DNA-DNA 接触を促進するが、Ter ドメインの DNA 遺伝子座と隣接領域の DNA 遺伝子座間の接触は防止する。MatP はどのようにして DNA を凝縮し、DNA-DNA 接触を促進するのだろうか。実験結果は矛盾している。MatP はin vitro で2 つのmatS部位の間に DNA ループを形成でき、その DNA ループ形成活性は MatP の四量体化に依存する。四量体化は DNA に結合した 2 つの MatP 分子間のコイルドコイル相互作用を介して起こる。[156] in vitro の結果に基づく 1 つの明らかなモデルは、MatP がmatS部位をブリッジすることによりin vivo でDNA-DNA 接触を促進するというものである。しかし、Hi-C 研究では MatP は離れた部位を接続したものの、 matS部位を具体的に接続したわけではない。さらに、四量体を形成できないMatP変異体は野生型と同様に振る舞った。これらの結果は、 Ter組織化のためのmatSブリッジングモデルに反論するもので、MatPの作用メカニズムは不明のままである。1つの可能性は、MatPが主要なmatS結合部位から近くのDNAセグメントに広がり、四量体形成に依存しないメカニズムを介して離れた部位をブリッジするというものである。[156]
ムクBEF
MukBは、真核生物における高次染色体構成に関与する染色体構造維持タンパク質（SMC）と呼ばれるATPaseファミリーに属している。 [145] 2つのMukBモノマーは、連続した反平行コイルドコイル相互作用を介して会合し、100 nm長の剛性ロッドを形成する。柔軟なヒンジ領域がロッドの中央に生じる。[162] [163]ヒンジ領域の柔軟性により、MukBはSMCファミリーの特徴的なV字型をとる。MukBと会合する非SMCサブユニットは、MukEとMukFである。会合によりV字型が閉じられ、大きなリング状構造が形成される。MukEとMukFは、大腸菌内でMukBとともに同じオペロンにコードされている。[164]いずれかのサブユニットを欠失しても同じ表現型が得られることから、MukBEF複合体が生体内での機能単位であることが示唆される。[160]複合体のDNA結合活性はMukBサブユニットに存在し、MukEとMukFはMukBの活性を調節する。[164]
MukBEF複合体は、Topo IVとともに、新たに複製されたoriCの脱連鎖化と再配置に必要である。[165] [166] [167] [168] [155] MukBEFの役割はDNA複製中だけに限定されない。それは、複製していない細胞でもDNAを組織化し、凝縮する。[131] MukBを欠損した大腸菌株の最近の高解像度染色体立体配座マップは、MukBがTerドメインを除く染色体全体でDNA-DNA相互作用の形成に関与していることが明らかになった。[126] MukBがTerドメインで作用するのをどのようにして防ぐのか？ MatPは物理的にMukBと相互作用し、それによってMukBがTerドメインに局在するのを防ぐ。[155]これは、TerドメインでのMatPとMukBのDNA結合から明らかである。 MatPのDNA結合はTerドメインで豊富であるのに対し、MukBのDNA結合はゲノムの他の部分と比較して減少している。さらに、すでにMatPを欠いている株では、MukBの不在により、Terドメインを含む染色体全体のDNA接触が減少します。[126]この結果は、MatPがMukBをTerドメインから追い出すという見解と一致しています。[126]
MukBEF複合体はどのようにして大腸菌の染色体を組織化するのでしょうか？現在の見解では、SMC複合体はDNAループを押し出すことで染色体を組織化します。[169] SMC複合体はDNAに沿って転座し、シス様式（同じDNA分子上）でループを押し出します。ループのサイズは複合体のプロセッシビティに依存します。異なる生物のSMC複合体は、ループ押し出しのメカニズムが異なります。[169]大腸菌のMukBEFの単一分子蛍光顕微鏡検査は、生体内の最小機能単位が二量体の二量体であることを示唆しています。[160]この単位は、ATP結合した2つのMukBEF複合体がMukFを介した二量体化によって結合することによって形成されます。MukBEFは、細胞の長軸に平行に細長い1〜3個のクラスターとして細胞内に局在します。各クラスターには、平均して約8〜10個の二量体が含まれています。現在のモデルによれば、MukBEFは「ロッククライミング」のようにDNAループを押し出します。[160] [170]二量体の二量体はDNAの1つのセグメントを解放し、染色体から解離することなく新しいDNAセグメントを捕捉します。DNAループに加えて、負のスーパーコイルと生体内MukBEF機能との間のリンクと、MukBサブユニットがin vitroで負のスーパーコイルを抑制する能力は、MukBEFがスーパーコイルを生成することによってDNAを整理することを示唆しています。[171] [172] [173]
NAPとnaRNAの役割
NAP は、より小さなスケール (約 1 kb) で DNA を曲げたり、橋渡ししたり、ループさせたりすることで染色体の圧縮に寄与するだけでなく、長距離 DNA-DNA 接触を促進することで DNA の凝縮と組織化にも関与しています。2 つの NAP、Fis と HU は、染色体全体で発生する長距離 DNA-DNA 接触を促進する上で重要な役割を果たしていることが明らかになりました。[126]より小さなスケール (約 1 kb) でよく理解されている Fis と HU の DNA 組織化活動がどのようにして長距離 DNA-DNA 相互作用の形成につながるのかはまだ研究されていません。とはいえ、HU を介した DNA 相互作用の一部には naRNA4 の存在が必要です。[86] naRNA4 も長距離 DNA 接触の形成に関与しています。HU は接触のすべてではなく一部を触媒するため、RNA が他の NAP と共に DNA 接触の形成に関与していることが示唆されます。HU は MukB と一緒に長距離 DNA-DNA 相互作用を促進するようにも思われます。この見解は、HUまたはMukBのいずれかが欠如すると、同じDNA-DNA接触が減少するという観察に基づいています。MukBとHUがDNA-DNA相互作用を促進するためにどのように一緒に作用するかは不明です。2つのタンパク質が物理的に相互作用する可能性はあります。あるいは、MukBEFが大きなDNAループを押し出す一方で、HUはそれらのループを凝縮して整理します。[169] [48]
遺伝子の機能的関連性の役割
大腸菌の機能的に関連する遺伝子は、遺伝的距離では離れているにもかかわらず、染色体内の3次元空間で物理的に一緒になっているという報告がある。機能的に関連する遺伝子の空間的な近接性は、生物学的機能をより区画化して効率的にするだけでなく、核様体の折り畳みと空間的組織化にも寄与すると考えられる。特定のDNA遺伝子座の検出に蛍光マーカーを使用した最近の研究では、遺伝的に互いに離れている（最大200万bp）7つのrRNAオペロン間のペアワイズ物理的距離が調べられた。rrn Cを除くすべてのオペロンが物理的に近接していると報告された。[174] [175] 驚くべきことに、3C-seq研究ではrrnオペロンの物理的なクラスター化は明らかにならず、蛍光ベースの研究の結果と矛盾した。[126]したがって、これらの矛盾する観察を解決するにはさらなる調査が必要である。別の例として、GalRは染色体全体に散在するGalR結合部位の相互作用ネットワークを形成する。[176] GalRはガラクトースレギュロンの転写調節因子であり、糖D-ガラクトースの輸送と代謝のための酵素をコードする遺伝子から構成される。[177] GalRは細胞内に1つまたは2つの焦点にのみ存在し[176]、大きな秩序ある構造に自己集合することができる。[178]そのため、DNAに結合したGalRは多量体化して長距離相互作用を形成すると思われる。[176] [178]
地球の形状と構造
化学的に固定した大腸菌細胞の従来の透過型電子顕微鏡（TEM）では、核様体は不規則な形の細胞小器官として描写されていた。しかし、生きた核様体の3D広視野蛍光イメージングでは、個別の楕円形が明らかになった。[3] [14] [15]細胞の位相差画像と核様体の蛍光画像を重ね合わせると、核様体の全長から細胞周縁部までの放射状次元でのみ近接していることが示された。この知見は、核様体が放射状に閉じ込められていることを示している。[13]長軸に垂直な断面を作製した後の3D蛍光画像の詳細な検査により、核様体の2つの全体的な特徴、すなわち曲率と縦方向の高密度領域がさらに明らかになった。各断面の強度の中心を結ぶことによって核様体の中心線のキラリティーを調べたところ、核様体全体の形状が湾曲していることが示された。[15]断面の蛍光強度分布から、中心核に湾曲した高密度領域または束があり、周辺に低密度領域がある密度サブ構造が明らかになった。[13] [14]放射状の閉じ込めの1つの意味は、それが核様体の湾曲した形状を決定することである。あるモデルによれば、核様体は、半径が曲げられる長さ（持続長）よりも短い円筒形の大腸菌細胞に閉じ込められているため、曲がらざるを得ない。 [13]このモデルは、細胞壁の除去または細胞壁合成の阻害によって細胞の半径が増加し、その結果、核様体のらせん半径が増加し、らせんピッチが減少するという観察結果によって裏付けられている。[13]
核様体と膜のつながり
DNA-膜結合による膨張力は、核様体の最適な凝縮レベルを維持するために、凝縮力に逆らって機能すると思われる。細胞分画と電子顕微鏡研究が、最初にDNA-膜結合の可能性を示した。[179] [180]現在、DNA-膜結合の例がいくつか知られている。トランサーションは、一時的なDNA-膜接触を形成する新生膜タンパク質の同時転写、翻訳、および挿入のメカニズムである。[181] 2つの膜タンパク質LacYとTetAのトランサーションは、膜に向かって染色体遺伝子座の再配置を引き起こすことが実証されている。[182]核様体-膜結合の別のメカニズムは、膜に固定された転写調節因子と染色体内の標的部位との間の直接接触を介して行われる。大腸菌の転写調節因子の一例はCadCである。 CadC には、細胞周縁部の感知ドメインと細胞質の DNA 結合ドメインが含まれています。その細胞周縁部の感知ドメインによる酸性環境の感知は、CadC の DNA 結合活性を刺激し、それが標的遺伝子の転写を活性化します。[183] 膜アンカー型転写制御因子によって制御される遺伝子の膜局在はまだ実証されていません。それでも、これらの制御因子による染色体中の標的遺伝子の活性化は、動的な接触ではあるものの、核様体と膜の接触をもたらすことが期待されます。これらの例以外にも、染色体は、DNA 結合タンパク質 (例: SlmA および MatP) と divisome との間のタンパク質間相互作用によっても細胞膜に特異的に固定されています。 [ 184] [185]膜タンパク質をコードする遺伝子はゲノム全体に分布しているため、転写による動的な DNA と膜の接触は、核様体の拡大力として作用する可能性があります。この膨張力は、凝縮力に対抗して作用し、最適な凝縮レベルを維持する。大腸菌細胞を翻訳を阻害するクロラムフェニコールにさらすと高度に凝縮した核様体が形成されるが、これはトランスサーションによって形成される一時的なDNA-膜接触の膨張力を支える。[186] [187]クロラムフェニコール処理後の過剰に凝縮した核様体の丸い形状は、トランスサーションを介したDNA-膜接触が核様体の楕円形を定義する役割を果たしていることを示唆している。[187]
視覚化
核様体は、非常に高倍率の電子顕微鏡写真ではっきりと観察することができ、その外観は異なるかもしれないが、細胞質に対してははっきりと見える。[188]時には、 DNAと思われる鎖さえも見える。DNAを特異的に染色するフォイルゲン染色で染色すると、核様体は光学顕微鏡でも観察できる。[189] DNA挿入染色であるDAPIとエチジウムブロマイドは、核様体の蛍光顕微鏡検査に広く使用されている。核様体は不規則な形をしており、原核細胞に見られる。[13] [14]
DNAの損傷と修復
細菌や古細菌の核様体の構造変化は、DNA損傷条件にさらされた後に観察される。枯草菌と大腸菌の核様体は、紫外線照射後には両方とも著しくコンパクトになる。[190] [191]大腸菌におけるコンパクト構造の形成には、特定のRecA-DNA相互作用によるRecAの活性化が必要である。 [192] RecAタンパク質は、DNA損傷の相同組換え修復において重要な役割を果たしている。
上記の枯草菌や大腸菌と同様に、古細菌のHaloferax volcaniiがDNAを損傷するストレスにさらされると、核様体の圧縮と再編成が起こります。[193]圧縮は、DNAの二本鎖切断の相同組換え修復の初期段階を触媒するMre11-Rad50タンパク質複合体に依存しています。核様体の圧縮は、DNA修復タンパク質が標的を見つけるのを助け、相同組換え中に無傷のDNA配列の探索を容易にすることで、細胞の回復を加速するDNA損傷応答の一部であると提案されています。[193]
参照
参考文献
この記事は、 CC BY 4.0ライセンス（2019）（査読者レポート）の下、以下のソースから改変されました：
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