X線顕微鏡

X線顕微鏡は、 X線帯の電磁波を利用して物体の拡大像を生成します。X線はほとんどの物体を透過するため、X線顕微鏡観察のために特別な前処理は必要ありません。

可視光線とは異なり、X線は反射や屈折しにくく、人間の目には見えません。そのため、X線顕微鏡はフィルムに露光するか、電荷結合素子（CCD）検出器を用いて試料を透過したX線を検出します。これは、炭素原子（生細胞を構成する主成分）と酸素原子（水を構成する成分）による、水の透過窓領域（波長：2.34～4.4  nm、エネルギー：280～530  eV）の軟X線の吸収率の差を利用したコントラストイメージング技術です。

マイクロフォーカスX線も投影によって高倍率を実現します。マイクロフォーカスX線管は、極めて小さな焦点スポット（5μm から0.1μmまで ）からX線を生成します。X線はより一般的なX線範囲（20～300keV）にあり 、再集束は行われません。

X線顕微鏡の歴史は20世紀初頭に遡ります。1895年にドイツの物理学者レントゲンがX線を発見した後、科学者たちはすぐにX線点光源を用いて物体を照射し、数マイクロメートルの解像度で物体の影の画像を捉えました。^{[ 2 ]} 1918年、アインシュタインは、ほとんどの媒質におけるX線の屈折率は1よりわずかに大きい必要があると指摘しました。 ^{[ 3 ]}これは、屈折光学部品をX線用途に使用することは難しいことを意味します。

ポール・カークパトリックとアルバート・バエズによる初期のX線顕微鏡は、X線を非常に高い入射角で放物面鏡に当てて集束させる、斜入射反射X線光学系を使用していた。X線を集束させる別の方法として、二酸化ケイ素基板上に同心円状の金またはニッケルのリングで構成された微小なフレネルゾーンプレートを使用する方法がある。ローレンス・ブラッグ卿は、1940年代後半に自身の装置を用いて、実用的なX線画像を初めていくつか作成した。

1950年代、スターリング・ニューベリーは、試料を線源とターゲットプレートの間に配置したシャドウX線顕微鏡を開発した。これが、ゼネラル・エレクトリック社が開発した最初の商用X線顕微鏡の基礎となった。

1960 年代の沈黙期を経て、X 線顕微鏡は 1970 年代に再び注目を集めるようになりました。1972 年、ホロウィッツとハウエルはケンブリッジ電子加速器で最初のシンクロトロンベースの X 線顕微鏡を構築しました。^{[ 4 ]}この顕微鏡は、小さなピンホールからのシンクロトロン放射光を使用してサンプルをスキャンし、透過顕微鏡と蛍光顕微鏡の両方の能力を示しました。この時期の他の開発には、日本の青木貞夫と菊田清志による最初のホログラフィックの実証^{[ 5 ]} 、シュマールらによるゾーンプレートを使用した最初の TXM ^{[ 6 ]}、ストーニーブルックのSTXMの実験^{[ 7 ] [ 8 ]}などがあります。

1980年代には、シンクロトロン光源の利用により、X線顕微鏡に新たな可能性がもたらされました。しかし、多くのグループで新しいシンクロトロン光源ベースの顕微鏡が構築されるにつれて、当時の技術的能力の不足、例えばコヒーレント照明の不十分さ、X線光学素子の品質の低さ、使い勝手の悪い光源などにより、そのような実験を行うことが困難であることが認識されました。^{[ 9 ]}

1990年代に入ると、新しい機器と新しい光源がX線顕微鏡の改良を大きく促進した。トモグラフィー、クライオ、クライオトモグラフィーなどの顕微鏡法が成功裏に実証された。急速な発展により、X線顕微鏡は土壌科学、地球化学、高分子科学、磁気学などの分野で新たな応用が見出された。ハードウェアも小型化され、研究者は自身の研究室で実験を行うことができるようになった。^{[ 9 ]}

集束電子ビームと液体金属陽極を使用する非シンクロトロンX線源を使用すると、焦点スポットが約10 μm × 10 μmの、  X線位相差顕微鏡用の極めて高強度の9.25 keV X線源が得られる可能性がある。これは2003年に実証され、2017年には約1立方マイクロメートルのボクセルサイズでマウスの脳を画像化するために使用された（下記参照）。^{[ 10 ]}  

応用分野が拡大し続けるにつれ、X線顕微鏡は環境科学、土壌科学、地球化学、宇宙化学、高分子科学、生物学、磁気学、材料科学において日常的に用いられる実績のある技術となった。これらの分野におけるX線顕微鏡の需要の高まりに伴い、シンクロトロン、液体金属陽極、その他の実験室用光源に基づく顕微鏡が世界中で構築されている。X線光学系およびコンポーネントも急速に商業化されている。^{[ 9 ]}

顕微鏡観察に適した軟X線源（シンクロトロン放射光源など）は、必要な波長の輝度がかなり低いため、画像形成の代替方法として走査透過型軟X線顕微鏡法が用いられる。この方法では、X線を一点に集束させ、試料を機械的にその焦点スポットを通過させる。各点において、透過したX線を比例計数管やアバランシェフォトダイオードなどの検出器で記録する。このタイプの走査透過型X線顕微鏡（STXM）は、ストーニーブルック大学の研究者によって最初に開発され、ブルックヘブン国立研究所の国立シンクロトロン光源施設で使用された。

X線顕微鏡の解像度は、光学顕微鏡と電子顕微鏡の中間に位置します。従来の電子顕微鏡に比べて、生物試料を自然な状態で観察できるという利点があります。電子顕微鏡は、ナノメートルからサブオングストロームレベルの解像度で画像を取得するために広く使用されていますが、比較的厚みのある生細胞は、試料を化学的に固定し、脱水し、樹脂に包埋し、超薄切する必要があるため、観察できません。ただし、クライオ電子顕微鏡では、水氷に包埋されているとはいえ、生物試料を水和した自然な状態で観察できることは特筆すべきです。これまで、シンクロトロンから放出される軟X線を使用して画像を形成するフレネルゾーンプレートレンズを使用して、30ナノメートルの解像度が可能でした。最近では、シンクロトロン放射光ではなく、レーザー生成プラズマから放出される軟X線の使用が普及しつつあります。

さらに、X線はほとんどの物質に蛍光を発するため、これらの発光を分析することで、画像化された物体の化学元素を特定することができます。また、 X線結晶学で用いられる回折パターンの生成にも利用されます。回折パターンの内部反射を（通常はコンピュータプログラムを用いて）分析することで、結晶の三次元構造を、分子内の個々の原子の位置まで特定することができます。試料が小さすぎて他の方法では分析できない場合、X線顕微鏡がこれらの分析に用いられることがあります。

生物学におけるX線顕微鏡の初期の応用例の1つは、1913年にゴビーによって開拓された接触イメージングです。この技術では、軟X線が試料に照射され、その下にあるX線感応乳剤が露出されます。次に、試料のX線不透明度マップに対応する乳剤の拡大断層画像が、光学顕微鏡または電子顕微鏡を使用して記録されます。X線接触イメージングが電子顕微鏡よりも提供した独自の利点は、湿った生物材料をイメージングできることでした。そのため、植物、昆虫、ヒト細胞の微細およびナノスケール構造の研究に使用されました。しかし、乳剤の歪み、不十分な照明条件、乳剤を検査する方法の解像度の低さなど、いくつかの要因が接触イメージングの解像度を制限します。乳剤の電子損傷と回折効果も、最終画像にアーティファクトを引き起こす可能性があります。^{[ 13 ]}

X線顕微鏡は、ナノスケールの解像度と高い透過能力という独自の利点を持ち、これらは生物学的研究で必要とされるものです。近年の機器と集束技術の著しい進歩により、回折光学^{[ 14 ]} 、反射光学^{[ 15 ] [ 16 ]} 、屈折光学^{[ 17 ]}という3つの古典的な光学形態はすべてX線領域にまで拡張され、細胞および細胞内スケールでの構造とダイナミクスの調査に使用されています。2005年、Shapiroらは、 コヒーレント軟X線回折顕微鏡を使用して30 nmの解像度で酵母の細胞イメージングを報告しました。^{[ 18 ]} 2008年には、染色されていないウイルスのX線イメージングが実証されました。^{[ 19 ]}その1年後、X線回折は染色されていないヒト染色体の3次元構造を可視化するためにさらに応用されました。^{[ 20 ]} X線顕微鏡は、従来の光学顕微鏡の回折限界を克服する優れた能力を示してきましたが、解像度のさらなる向上は、検出器のピクセル、光学機器、および光源のサイズによって制限されます。

X線顕微鏡検査における長年の大きな懸念事項は放射線損傷であり、高エネルギーX線は強力なラジカルを生成し、湿潤試料に有害な反応を引き起こす。そのため、生物学的試料は通常、高出力X線を照射する前に固定または凍結乾燥される。また、無傷の水和構造を保存するために、急速凍結処理も一般的に用いられる。^{[ 21 ]}

• X線コンピュータ断層撮影
• 電子顕微鏡
• 中性子顕微鏡

• 山本 裕、篠原 健（2002 年 10月）。「生きた水和細胞の解析における X 線顕微鏡の応用」。Anat . Rec . 269 (5): 217–23 . doi : 10.1002/ar.10166 . PMID 12379938. S2CID 43009840 .  
• 上條 奈緒、鈴木 裕、淡路 雅彦 他 (2002 年 5 月) 「スパッタリングスライスフレネルゾーンプレートを用いた硬 X 線マイクロビーム実験とその応用」シンクロトロン放射光ジャーナル9 ( Pt 3): 182–6 . doi : 10.1107/S090904950200376X . PMID 11972376 . 
• 軟X線顕微鏡の科学的応用
• Arndt Last. 「X線顕微鏡」 。 2019年11月19日取得。