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誘導細胞周期停止とは、化学的または遺伝的操作を用いて細胞周期の進行を人為的に停止させることである。ゲノム複製や細胞分裂などの細胞プロセスが停止する。[ 1 ]一時的な場合もあれば、永続的な場合もある。[ 1 ]これは、実験者によって制御される外因性刺激によって誘導される、自然発生的な細胞周期チェックポイントの人為的な活性化である。
学術研究の文脈では、細胞周期停止は通常、サッカロミセス・セレビシエ（酵母）やゼノパス卵母細胞（カエルの卵）などのモデル生物や細胞抽出物で行われます。 [ 2 ] [ 3 ]カエルの卵細胞抽出物は、直径が1mmに達する比較的大きいため、タンパク質を多く含み、タンパク質レベルをより簡単に測定できるため、細胞周期研究で広く使用されています。[ 4 ]
研究者が細胞周期の進行を一時的または永続的に阻止したいと考える理由は様々である。
実験によっては、研究者は細胞群が細胞周期の次の段階に進むタイミングを制御し、同期させたい場合があります。[ 5 ]細胞は、特定の段階に（異なる時点で）到達したときに停止するように誘導することができ、停止が解除されたとき（例えば、別の化学物質を導入して細胞周期の進行を回復させたとき）、すべての細胞が同時に細胞周期の進行を再開します。この方法は、細胞が細胞周期を再開するタイミングの科学的制御として機能するだけでなく、必要性と十分性を調査するためにも使用できます。
同期が重要なもう一つの理由は、DNA含有量の制御であり、これは、前回の有糸分裂と細胞質分裂の完了以降にDNA複製が行われたかどうかに基づいて、細胞周期のさまざまな段階で変化する。[ 6 ]
さらに、多数の細胞を同じ位相に同期させることで、ウェスタンブロットやRNAシーケンスなどの他のアッセイで使用するのに十分な数の細胞を同じサイクルで収集することが可能になります。[ 7 ]
研究者たちはDNA損傷修復のメカニズムを研究している可能性がある。細胞周期停止を誘導する以下のメカニズムの中にはDNA損傷を伴うものもあるため、これにより細胞が遺伝物質の損傷にどのように反応するかを調査することができる。[ 8 ]
特定の遺伝子をノックアウトした細胞の遺伝子工学的操作によって、細胞周期の異なる段階で停止する細胞を作り出すことも可能です。例としては、以下のようなものがあります。
G 1期は細胞周期の4つの段階のうち最初の段階であり、間期の一部です。G 1期では、細胞は間期の次の段階である有糸分裂に備えてメッセンジャーRNA（mRNA）とタンパク質を合成します。ヒトの体細胞では、細胞周期は約18時間続き、G 1期はその時間の約1/3を占めます。 [ 13 ]一方、カエル、ウニ、ショウジョウバエの胚では、G 1期は非常に短く、細胞質分裂とS期の間のわずかなギャップとなっています。[ 13 ]
α因子は、サッカロミセス・セレビシエが分泌するフェロモンで、酵母細胞をG1期で停止させる。これは、アデニル酸シクラーゼという酵素を阻害することによって起こる。[ 2 ]この酵素は、アデノシン三リン酸（ATP）を3',5'-環状AMP（cAMP）とピロリン酸に変換する反応を触媒する。[ 14 ]
接触阻害は、隣接する細胞が互いに接触したときに細胞を停止させる方法です。その結果、停止した細胞が単層に並び、このプロセスは癌細胞では著しく欠如しています。疑われるメカニズムは、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子であるp27 Kip1に依存しています。[ 15 ]停止した細胞ではp27 Kip1タンパク質レベルが上昇しています。この自然なプロセスは、 p27 Kip1の過剰発現によって実験室で模倣することができ、その結果、 G1期での細胞周期停止が誘導されます。[ 16 ]
ミモシンは植物由来のアミノ酸で、リンパ芽球様細胞を含む一部のヒト細胞において、G 1期以降の進行を可逆的に阻害することが示されている。[ 5 ]その作用機序は、細胞内の鉄を枯渇させる鉄/亜鉛キレート剤であると考えられている。これにより、DNAに二本鎖切断が生じ、DNA複製が阻害される。これは、鉄依存性リボヌクレオチド還元酵素の作用を阻害することを含む可能性がある。また、亜鉛依存性のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの転写を阻害する可能性もある。 [ 17 ]
細胞培養において、血清は細胞が増殖する培地であり、重要な栄養素を含んでいます。血清除去（血清とその栄養素を部分的または完全に除去すること）の使用は、例えば新生児哺乳類アストロサイト[ 18 ]やヒト包皮線維芽細胞[ 19 ]において、細胞周期の進行をG0期で停止および同期させることが示されています。
アミノ酸飢餓も同様のアプローチです。メチオニンなどの必須アミノ酸を含まない培地で培養すると、一部の細胞はG1期初期で停止します。[ 5 ]
S期はG1期に続いてG1 /S期移行を経て始まり、間期のG2期に先行し、細胞周期においてDNAが複製される段階である。ゲノムの正確な複製は細胞分裂の成功に不可欠であるため、S期に起こるプロセスは厳密に制御され、広く保存されている。S期前に組み立てられた複製前複合体は、活性複製フォークに変換される。[ 20 ]この変換を駆動するのはCdc7とS期サイクリン依存性キナーゼであり、これらは両方ともG1/S期移行後に発現が上昇する。[ 20 ]
アフィジコリンは、真菌Cephalosporum aphidicolaから単離された抗生物質です。これは、真核生物の核DNA複製を可逆的に阻害し、S期以降の進行を阻害します。そのメカニズムは、DNAポリメラーゼAとDの阻害です。構造研究では、これはポリメラーゼのα活性部位に結合し、「鋳型グアニンを回転」させることで、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）の結合を阻害することによって起こると考えられています。[ 21 ]このS期阻害は、HeLa細胞にアポトーシスを誘導します。[ 5 ]
ヒドロキシ尿素（HU）は、リボヌクレオチド還元酵素（RNR）を阻害する低分子薬であり、デオキシリボヌクレオチド（DNT）からリボヌクレオチドへの変換の触媒作用を阻害します。RNR内にはチロシルフリーラジカルが存在し、 HUによって不活性化されると考えられています。[ 6 ] [ 22 ]フリーラジカルはDNTの還元に必要であり、代わりにHUによって除去されます。[ 23 ] HUは、S期（健康な細胞）と細胞分裂直前（変異細胞）の両方で細胞周期を停止させることが示されています。[ 22 ]
2 3-(2,3-ジクロロフェノキシ)プロピルアミノエタノール(2,3-DCPE)は、S期停止を誘導する低分子化合物である。 [ 24 ]これは癌細胞株で実証されており、シトクロムcなどのミトコンドリア内容物の放出を防ぐ抗アポトーシス蛋白質であるB細胞リンパ腫-エクストララージ( Bcl-XL )の発現を下方制御する。
G2期は間期の最終段階であり、有糸分裂の直前に起こります。通常の細胞では、S期におけるDNA複製が正常に完了した場合にのみG2期に入ります。この期間は細胞が急速に成長し、タンパク質合成が行われる時期であり、細胞は有糸分裂に向けて準備を整えます。
サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼを活性化することで細胞周期の進行を制御するタンパク質です。細胞の内因性サイクリンメッセンジャーRNAを破壊すると、カエル卵抽出液は間期で停止し、有糸分裂に入ることができなくなります。[ 3 ]外因性サイクリンmRNAを導入するだけでも、細胞周期の進行を回復できます。[ 3 ]この破壊方法の1つは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することです。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、サイクリンmRNAに結合し、mRNAがサイクリンタンパク質に翻訳されるのを阻害するRNA断片です。[ 25 ]これは、 G2期だけでなく、他の相特異的サイクリンを破壊するためにも使用できます。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるサイクリンD1 mRNAの破壊は、 G1期からS期への進行を阻害します。[ 26 ]
有糸分裂は細胞周期の最終段階であり、間期に続く。有糸分裂は前期、中期、後期、終期の4つの段階からなり、核内での染色体の凝縮、核膜の消失、紡錘糸による姉妹染色分体の分離を伴う。有糸分裂が終了すると、紡錘糸は消失し、2組の染色体それぞれを囲むように核膜が再形成される。有糸分裂が成功すると、細胞は細胞質分裂と呼ばれる過程を経て、物理的に2つの同一の娘細胞に分裂し、細胞周期の1サイクルが完了する。これらの新しい細胞はそれぞれ、 G1期に再び入り、細胞周期を再開する可能性がある。
ノコダゾールは微小管の重合を阻害する化学物質である。[ 27 ]ノコダゾールで処理した細胞は、フローサイトメトリーで確認できるG2期またはM期のDNA含量で停止する。顕微鏡観察により、細胞は有糸分裂に入るが、微小管が重合できないため、中期に必要な紡錘体を形成できないことが判明している。[28] メカニズムの研究から、チューブリンがα /βヘテロ二量体を形成するのを阻害する可能性が示唆されている。[ 29 ]
タキソールはノコダゾールとは逆の作用機序で働き、微小管ポリマーを安定化させて分解を防ぎます。また、姉妹染色分体を分離するはずの紡錘体が分解できないため、M期停止を引き起こします。[ 30 ] [ 31 ]タキソールは微小管ポリマー上の特定の結合部位を介して作用するため、チューブリン重合を誘導するためにGTPや他の補因子を必要としません。[ 32 ]
温度はHeLa細胞の細胞周期の進行を調節することが示されている。有糸分裂は細胞周期の中で最も温度感受性の高い部分であることがわかった。[ 33 ] 細胞質分裂前の有糸分裂停止は、24～31 ℃（75.2～87.8 °F）の通常より低い温度で有糸分裂中の細胞が蓄積することによって確認された 。[ 33 ]
細胞が適切な段階で停止していることを確認するために使用できる方法はいくつかあります。
フローサイトメトリーは、レーザーとタンパク質マーカーに共有結合した蛍光色素を用いて細胞集団の物理的および化学的特性を測定する技術です。[ 34 ]シグナルが強いほど、特定のタンパク質が多く存在します。DNA色素であるヨウ化プロピジウムまたは4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色すると、G1、 S、またはG2 / M期の細胞を区別または選別することができます。[ 35 ]
イムノブロッティングとは、組織サンプルまたは抽出物中の特定のタンパク質を検出する手法です。まず、一次抗体が目的のタンパク質を認識して結合し、次に一次抗体を認識する二次抗体を添加します。その後、染色または免疫蛍光法によって二次抗体を可視化することで、元の標的タンパク質を間接的に検出します。
免疫ブロッティングは、細胞周期を調節するタンパク質であるサイクリンの存在を検出するために実行できます。 [ 36 ]異なるクラスのサイクリンは、細胞周期の異なる段階でアップレギュレーションとダウンレギュレーションされます。停止した細胞の抽出物からサイクリンを測定すると、細胞がどの段階にあるかを判断できます。たとえば、サイクリンEタンパク質のピークはG1 / S移行を示し、サイクリンAのピークは後期G2期を示し、サイクリンBのピークは有糸分裂を示します。[ 37 ]
FUCCIは、細胞周期の段階特異的なタンパク質の発現とユビキチン-プロテアソーム経路によるタンパク質の分解を利用するシステムです。蛍光タンパク質に結合した2つの蛍光プローブ（Cdt1とGeminin）により、細胞がどの細胞周期段階にあるかをリアルタイムで可視化できます。[ 38 ]
{{cite journal}}: CS1メンテナンス: DOIは2025年7月現在非アクティブです（リンク）