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リボヌクレオチド還元酵素（RNR ）は、リボヌクレオシド二リン酸還元酵素とも呼ばれ、リボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドの形成を触媒する酵素です。[ 1 ] [ 2 ]この酵素は、ヌクレオシド二リン酸（RNRの種類によっては三リン酸）のリボース環の2'-ヒドロキシル基を除去することによって、この形成を触媒します。この還元により、デオキシリボヌクレオチドが生成されます。[ 3 ]デオキシリボヌクレオチドは、 DNAの合成に使用されます。RNRによって触媒される反応は、すべての生物で厳密に保存されています。[ 4 ]さらに、RNRは、細胞分裂とDNA修復中にDNAと細胞質量の比率が一定に保たれるように、DNA合成の総速度を調節する上で重要な役割を果たします。[ 5 ] RNR酵素のやや珍しい特徴は、フリーラジカル機構を介して進行する反応を触媒することです。 [ 6 ] [ 7 ] RNRの基質はADP、GDP、CDP、UDPです。dTDP（デオキシチミジン二リン酸）は、別の酵素（チミジル酸キナーゼ）によってdTMP（デオキシチミジン一リン酸）から合成されます。
リボヌクレオチド還元酵素は3つのクラスに分類されます。クラスI RNR酵素は、大きなαサブユニットと小さなβサブユニットから構成され、これらが結合して活性なヘテロ二量体四量体を形成します。NDPを2'-dNDPに還元することで、この酵素はDNA合成の前駆体であり細胞増殖に不可欠なデオキシリボヌクレオチド（dNTP）のde novo合成を触媒します。[ 8 ]クラスII RNRは、アデノシルコバラミンのC-Co結合のホモリティック開裂により5'-デオキシアデノシルラジカルを生成します。さらに、クラスIII RNRは安定なグリシルラジカルを含んでいます。[ 9 ]
ヒトはクラスI RNRを保有している。αサブユニットはRRM1遺伝子によってコードされ、βサブユニットにはRRM2遺伝子とRRM2B遺伝子によってコードされる2つのアイソフォームが存在する。
各クラスIアルファモノマーは3つのドメインから構成される：[ 10 ]
Pfamでは、2番目のドメインは2つの別々のドメインとして解釈されています。
クラス I β サブユニットは通常、二金属中心と安定なチロシルラジカルを含んでいます。ヒトでは、β サブユニットは二鉄補因子に依存しています。大腸菌では、チロシルラジカルは位置 122 (Y122) にあり、クラス I RNR2 サブユニットに安定なラジカルを提供します。[ 14 ]ネッタイシマカでは、このチロシルラジカルは位置 184 (Y184) にあります。[ 15 ]チロシルラジカルは、疎水性環境のタンパク質内部に深く埋もれており、チロシルラジカルの安定化に使用される鉄中心の近くにあります。 2 つの μ-オキソ結合鉄の構造は、鉄結合部位として機能するリガンドによって支配されています。4 つのカルボキシレート[アスパラギン酸(D146)、グルタミン酸(E177、E240、および E274) ]と 2 つのヒスチジン(H180 および H277) です。[ 15 ] RNR2 の C 末端とRNR1 のC 末端の間で会合が起こります。[ 10 ]酵素活性は、RNR1 および RNR2 サブユニットの会合に依存します。活性部位は、RNR1 の活性ジチオール基と、RNR2 サブユニットの二価鉄中心およびチロシルラジカルから構成されます。
RNR2 の他の残基、例えばアスパラギン酸 (D273)、トリプトファン(W48)、チロシン (Y356) は、活性部位のチロシルラジカルをさらに安定化させ、電子移動を可能にする。[ 10 ]これらの残基は、RNR2 のチロシン (Y122) から RNR1 のシステイン(C439)へのラジカル電子の移動を助ける。電子移動は RNR2 のチロシン (Y122) で始まり、RNR2 内でトリプトファン (W48) まで続く。トリプトファン (W48) は RNR1 のチロシン (Y731) から 2.5ナノメートル離れている。RNR2 から RNR1 への電子移動は、チロシン (Y356 から Y731) を介して起こり、活性部位のチロシン (Y730) からシステイン (C439) まで続く。 RNR一次構造の部位特異的変異は、上記のすべての残基が活性部位へのフリーラジカルの長距離移動に関与していることを示している。[ 10 ]
ネッタイシマカでは、RNR1は、アロステリック調節に必要なアスパラギン酸 (D64) およびバリン (V292 または V284)、疎水性活性部位に位置するプロリン(P210 および P610)、ロイシン(L453 および L473)、およびメチオニン(M603) 残基、活性部位での水素原子の除去とラジカル電子の移動に関与するシステイン (C225、C436 および C451) 残基、リボヌクレオチド基質に結合するシステイン (C225 および C436)、アスパラギン(N434)、およびグルタミン酸 (E441) 残基、ラジカル移動を決定するチロシン (Y723 および Y743) 残基など、重要なアミノ酸残基のほとんどを保持しています。活性部位のジチオール基の再生に使用されるシステイン（C838およびC841）残基。[ 15 ]
酵母Saccharomyces cerevisiae は、酵母 染色体 IX 上にRNR3またはYIL066Cという名称でリボヌクレオチド二リン酸還元酵素の大きなサブユニットのマイナーアイソフォームを持っています。 [ 16 ]これは酵母RNR1のパラログであり、おそらく全ゲノム重複イベントから生じたものです。[ 17 ] RNR複合体は、小さなサブユニットの局在化を介してDNA 複製およびDNA 損傷チェックポイント経路によって制御されるdNTP合成の律速段階を触媒します。
酵素リボヌクレオチド還元酵素（RNR）は、dNDPの合成を触媒します。[ 18 ]フリーラジカルがリボースのCH結合から水素を引き抜きます。1回の還元後、RNRはチオレドキシンまたはチオレドキシン様タンパク質（例：NrdH）のジチオール基から供与される電子を必要とします。[ 19 ] [ 20 ]ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH ）がチオレドキシンのジスルフィド基を還元するために使用される2つの水素原子を提供すると、チオレドキシンの再生が起こります。[ 20 ]
RNR の 3 つのクラスは、NDP の還元に類似したメカニズムを持ちますが、フリーラジカルを生成するドメイン、メタロプロテイン構造内の特定の金属、および電子供与体が異なります。すべてのクラスはフリーラジカルを使用します。[ 10 ]クラス I 還元酵素は、鉄中心と二価鉄から三価鉄への変換を使用してチロシルラジカルを生成します。NDP 基質の還元は好気性条件下で起こります。クラス I 還元酵素は、調節の違いにより IA と IB に分けられます。クラス IA 還元酵素は、真核生物、真正細菌、バクテリオファージ、およびウイルスに分布しています。クラス IB 還元酵素は真正細菌に見られます。クラス IB 還元酵素は、二核マンガン中心の安定化によって生成されたラジカルも使用できます。さらに、クラス IB は、NrdH として知られるチオレドキシン様タンパク質から電子を受け取ります。[ 19 ]クラス II 還元酵素は、コバラミン(補酵素 B12)からフリーラジカル5'-デオキシアデノシルラジカルを生成し、クラス I および III 還元酵素よりも単純な構造を持つ。 NDP またはリボヌクレオチド 5'-三リン酸 (NTP) の還元は、好気性または嫌気性のどちらの条件下でも起こる。 クラス II 還元酵素は、古細菌、真正細菌、およびバクテリオファージに分布している。 クラス III 還元酵素は、S-アデノシルメチオニンと鉄硫黄中心の助けを借りて生成されたグリシンラジカルを使用する。 NTP の還元は嫌気性条件に限定される。 クラス III 還元酵素は、古細菌、真正細菌、およびバクテリオファージに分布している。[ 10 ] [ 15 ]生物は、1 つのクラスの酵素を持つことに限定されない。例えば、大腸菌はクラスIとクラスIIIの両方のRNRを持っている。
リボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドへの還元に現在受け入れられているメカニズムは、次の図に示されています。最初のステップでは、ラジカルCys439によって基質1の3'-Hが引き抜かれます。続いて、Cys225とGlu441によって触媒される反応では、リボヌクレオチドの炭素C-2'から1分子の水が脱離します。3番目のステップでは、Cys462からCys225へのプロトン移動の後、Cys225から2'-ケチルラジカル3の炭素C-2'への水素原子移動が起こります。このステップの最後に、ラジカルアニオンジスルフィド結合と閉殻ケトン中間体4が得られます。この中間体は、いくつかの2'-置換基質アナログの変換中、および酵素変異体と相互作用する天然基質[ 21 ]で確認されています。次の段階では、アニオン性ジスルフィド結合が酸化され、同時に基質が還元されて化合物5が生成される。スピン密度は硫黄原子から基質のC-3'原子へと移動し、同時にGlu441から炭素C-3'へプロトンが移動する。最後の段階は最初の段階の逆であり、Cys439からC-3'への水素移動が起こり、最初のラジカルが再生されて最終生成物6が得られる。
R1タンパク質の完全なモデルを使用したこれらのメカニズムのいくつかのステップの理論モデルは、Cerqueiraらによって行われた研究で見つけることができます。[ 22 ] [ 23 ]
クラスI RNRはRNR1とRNR2サブユニットから構成され、これらは会合してヘテロ二量体四量体を形成することができる。[ 6 ] RNR1には基質特異性と活性の調節を媒介するアロステリック部位が両方とも含まれている。[ 12 ]アロステリック構成に応じて、4つのリボヌクレオチドのうちの1つが活性部位に結合する。
RNR の調節は、dNTP のバランスのとれた量を維持するように設計されています。エフェクター分子の結合は、RNR 活性を増減させます。ATP がアロステリック活性部位に結合すると、RNR が活性化されます。対照的に、dATP がこの部位に結合すると、RNR が不活性化されます。[ 10 ]アロステリック機構は、活性を制御するだけでなく、基質特異性も調節し、酵素が DNA 合成のために各 dNTP を等量生成することを保証します。[ 10 ]すべてのクラスにおいて、ATP または dATP がアロステリック部位に結合すると、シチジン 5'-二リン酸 (CDP) およびウリジン 5'-二リン酸 (UDP) の還元が誘導されます。2'-デオキシグアノシン 5'-三リン酸 (dGTP) は、アデノシン 5'-二リン酸 (ADP) の還元を誘導します。また、2'-デオキシチミジン5'-三リン酸（dTTP）はグアノシン5'-二リン酸（GDP）の減少を誘導する（図1）。
クラス IB 還元酵素は、アロステリック活性部位に必要な N 末端アミノ酸が約 50 個欠けているため、dATP によって阻害されません。[ 24 ]さらに、損傷のない DNA の合成は、バランスの取れたデオキシリボヌクレオチドのプールに依存するため、リボヌクレオチド還元酵素の活性が転写および転写後制御下にあることが重要です。[ 25 ] クラス IA 還元酵素を持つ真核細胞は、dNTP が蓄積すると合成を停止する負の制御機構を持っています。この機構は、バランスの取れた dNTP プールの変化が DNA 損傷と細胞死につながるため、dNTP の過剰生産から生じる可能性のある毒性および変異原性効果から細胞を保護します。[ 26 ] [ 27 ] dNTP の過剰生産または不均衡な供給は、ヌクレオチドの DNA への誤取り込みにつながる可能性がありますが、dNTP の供給は DNA 修復を可能にします。 p53R2は、このような修復を誘導できるリボヌクレオチド還元酵素の小サブユニットである。このp53誘導R2ホモログ内の変化はミトコンドリアDNAの枯渇を引き起こす可能性があり、その結果、p53R2はdNTP供給の主要な因子として機能する。[ 28 ]
リボヌクレオチド還元酵素（RNR）は、すべての生細胞におけるDNA複製と修復に不可欠なデオキシリボヌクレオチドの新規合成を担う重要な酵素です。その臨床的意義は、細胞増殖とゲノムの完全性における中心的な役割から生じ、がん生物学における重要な因子となっています。腫瘍学では、RNR活性は悪性細胞で頻繁に上昇し、そこで急速なDNA合成と腫瘍の増殖を促進します。RRM2などの特定のRNRサブユニットの過剰発現は、膵臓がんや慢性リンパ性白血病を含むさまざまながんにおいて、予後不良、化学療法耐性の増加、および好ましくない結果と相関しています。RNR発現、特にRRM1サブユニットの予後価値は、バイオマーカーと標的療法の潜在的な標的の両方として研究されています。[ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]
治療上、RNRは抗がん剤の確立された標的であり、ゲムシタビンやヒドロキシ尿素などの薬剤はRNRを阻害することで効果を発揮し、それによってDNA合成を阻害し、がん細胞の生存能力を低下させる。RNRとそのサブユニットを標的とした新規阻害剤や戦略は、薬剤耐性を克服し、がん治療の成果を向上させるために引き続き研究されている。さらに、この酵素はデオキシリボヌクレオチドプールのバランスを維持する上で重要な機能を持ち、原核生物や一部のウイルスにおいて必須であることから、がん治療だけでなく抗菌剤や抗ウイルス剤の開発の標的としても位置づけられている。[ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] RNRを止められれば、がんの進行を止めることができる。したがって、この酵素はがん治療の古典的な標的と考えられている。[ 37 ]
一般的にクラスI RNR阻害剤は、酵素の合成を阻害する翻訳阻害剤、2つのRNRサブユニット（R1とR2）の結合を阻害する二量体化阻害剤、およびサブユニットR1および/またはサブユニットR2を不活性化する触媒阻害剤の3つの主要なグループに分類できます。[ 22 ]
クラスI RNRは、RNR2のC末端に類似したペプチドによって阻害される可能性がある。これらのペプチドはRNR1への結合に関してRNR2と競合することができ、その結果、RNR1はRNR2と酵素活性複合体を形成しない。[ 38 ] [ 39 ] RNR2タンパク質のC末端は種によって異なるが、RNR2は種を超えてRNR1と相互作用することができる。[ 40 ]マウスRNR2のC末端を大腸菌RNR2のC末端（7または33）アミノ酸残基に置き換えた場合、キメラRNR2サブユニットは依然としてマウスRNR1サブユニットに結合する。しかし、RNR2からRNR1サブユニットへのフリーラジカル電子の伝達に関与する残基が除去されたためか、酵素活性を欠いている。[ 39 ]
小さなペプチドは、通常の RNR2 C 末端と大きな類似性がある場合、RNR2 サブユニットが RNR1 に結合するのを特異的に阻害することができます。[ 41 ]この RNR2 と RNR1 の結合の阻害は、単純ヘルペスウイルス (HSV) RNR で成功裏にテストされています。競合アッセイで RNR2 サブユニットの C 末端から切り出された 7 アミノ酸オリゴマー (GAVVNDL) を使用すると、通常の RNR2 が RNR1 と酵素活性複合体を形成するのを阻止しました。[ 42 ] RNR2 C 末端に類似した他の小さなペプチド阻害剤も、HSV RNR の酵素活性を阻害し、HSV の複製を阻害するために成功裏に使用されています。[ 43 ]間質性角膜炎および角膜新生血管形成( HSV眼疾患)のマウスモデルでは、小さな RNR2 C 末端アナログ BILD 1263 が RNR を阻害し、これらの疾患の予防に効果的であることが報告されています。[ 44 ]場合によっては、小さな C 末端アナログによる治療では病気の蔓延を止められないかもしれないが、治癒には役立つことがある。アシクロビル耐性 HSV (PAAr5) では、小さなペプチド阻害剤 BILD 1633 が皮膚 PAAr5 感染に対して BILD 1263 より 5 ～ 10 倍強力であることが報告されている。[ 45 ]併用療法 (BILD 1633 とアシクロビル) は、マウスの局所病変の治癒に効果的である。これらのデータは、RNR1 への結合に関して RNR2 と競合する小さなペプチド阻害剤が HSV の蔓延を防ぐのに役立つことを示唆している。
ガリウムは活性部位のFe3 +と置換することでRNR2を阻害する。ガリウムマルトレートは経口投与可能なガリウムの一種で、この阻害活性を利用して癌、感染症、その他の疾患を治療する。[ 46 ]
ヒドロキシ尿素[ 47 ]とモテキサフィンガドリニウムという薬は、この酵素の働きを阻害する。[ 48 ]