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G 2期、ギャップ 2 期、または成長 2 期は、細胞周期において有糸分裂の直前にある間期の 3 番目のサブフェーズです。これは、細胞のDNAが複製されるS 期の正常な完了に続きます。G 2期は、細胞のクロマチンが染色体に凝縮される有糸分裂の最初のフェーズである前期の開始とともに終了します。
G 2期は、細胞が有糸分裂に向けて準備する、急速な細胞増殖およびタンパク質合成の期間である。興味深いことに、G 2期は細胞周期の必須部分ではなく、一部の細胞タイプ（特に若いアフリカツメガエルの胚[1]および一部の癌[2] ）は DNA 複製から有糸分裂に直接進む。G2 期およびそれに続く有糸分裂への移行を制御する遺伝子ネットワークについては多くのことが分かっているが、その重要性および制御については、特に癌に関して、まだ多くのことが解明されていない。1 つの仮説は、G 2期での成長は細胞サイズの制御方法として制御されているというものである。分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe ）は、 Cdr2を介したWee1活性の空間制御を介して、そのようなメカニズムを採用することが以前に示された。[3] Wee1 は有糸分裂移行のかなり保存された負の調節因子であるが、G2 における細胞サイズの制御の一般的なメカニズムはまだ解明されていない。
生化学的には、G 2期の終わりは、成熟促進因子(MPF)としても知られる活性サイクリン B1 / CDK1複合体の閾値レベルに達したときに起こります。[4]この複合体の活性は G 2期中に厳密に制御されています。特に、G 2チェックポイントは、CDK1 の抑制制御を通じて、DNA 損傷に反応して G 2 期の細胞を停止させます。
相同組換え修復
有糸分裂のS期では、DNA複製によってほぼ同一の姉妹染色分体2つが生成される。複製が進行した後またはG2期中に生じたDNA二重鎖切断は、細胞分裂が起こる前（細胞周期のM期）に修復することができる。したがって、G2期中に、一方の姉妹染色分体の二重鎖切断は、もう一方の無傷の姉妹染色分体をテンプレートとして使用して相同組換え修復によって修復される可能性がある。[5]
Gの終わり2/有糸分裂の開始
有糸分裂の開始は、活性サイクリン B1/CDK1 複合体（サイクリン B1/Cdc2 または成熟促進因子(MPF) としても知られる）の閾値レベルによって決定されます。活性サイクリン B1/CDK1 は、中心体の分離、核膜の崩壊、紡錘体の組み立てなど、初期の有糸分裂における不可逆的な作用を引き起こします。脊椎動物には 5 つのサイクリン Bアイソフォーム( B1、B2 、B3、B4、B5)がありますが、有糸分裂の開始を制御する上でこれらのアイソフォームそれぞれが果たす具体的な役割はまだ明らかになっていません。サイクリン B1 はサイクリン B2 の両方の喪失を補うことができることが知られています ( Drosophilaではその逆も同様)。[6] Saccharomyces cerevisiaeには 6 つの B 型サイクリン (Clb1-6) が含まれており、Clb2 が機能に最も重要です。脊椎動物とS. cerevisiaeの両方において、複数のB型サイクリンが存在することで、異なるサイクリンがG2/M遷移の異なる部分を制御できると同時に、遷移を摂動に対して堅牢にすることができると推測されています。[7]
以降の議論では、哺乳類細胞におけるサイクリン B1/CDK の空間的および時間的活性化に焦点を当てますが、同様の経路が他の後生動物と S. cerevisiae の両方に適用できます。
サイクリンB1の合成と分解
サイクリンB1のレベルは、サイクリンB1をタンパク質分解の標的とするE3ユビキチンリガーゼである後期促進複合体（APC）によってG1期およびS期を通じて抑制されます。転写は、上流のG1およびG1/Sサイクリン-CDK複合体によるNF-Y、FoxM1、B-Mybなどの転写因子のリン酸化に応答して、DNA複製後のS期の終わりに始まります。 [8]
サイクリンB1/CDK1活性の調節
サイクリン B1 レベルの増加は、G2 全体を通じてサイクリン B1-CDK1 複合体レベルの上昇を引き起こしますが、複合体は Wee1 および Myt1 キナーゼによる阻害性リン酸化のため、G2/M 遷移前は不活性のままです。Wee1 は主に核に局在し、Tyr15 部位に作用しますが、Myt1 は ER の外表面に局在し、主に Thr14 部位に作用します。
Wee1 と Myt1 の効果は、cdc25 ファミリーのホスファターゼによって打ち消され、CDK1 上の阻害性リン酸を除去して、サイクリン B1-CDK1 複合体を完全に活性化された形態である MPF に変換します。
活性サイクリンB1-CDK1は、Wee1およびCdc25アイソフォームAとCの活性をリン酸化して調節します。具体的には、CDK1リン酸化はWee1キナーゼ活性を阻害し、中間キナーゼPLK1を活性化することでCdc25Cホスファターゼ活性を活性化し、Cdc25Aを安定化します。したがって、CDK1はCdc25と正のフィードバックループを形成し、Wee1と二重の負のフィードバックループを形成します（本質的には正の正のフィードバックループです）。
正のフィードバックとスイッチのような活性化
これらの正のフィードバック ループは、サイクリン B1 レベルに対する CDK1 活性のヒステリシス 双安定スイッチをコード化します (図を参照)。このスイッチは、サイクリン B1 濃度の双安定領域にわたる 2 つの異なる安定平衡によって特徴付けられます。1 つの平衡は間期に対応し、サイクリン B1/CDK1 および Cdc25 の不活性、および Wee1 および Myt1 の高レベルの活性によって特徴付けられます。もう 1 つの平衡は M 期に対応し、サイクリン B1/CDK1 および Cdc25 の高活性、および Wee1 および Myt1 の低活性によって特徴付けられます。双安定の範囲内で、細胞の状態は、その細胞が以前間期にあったか M 期にあったかによって異なります。M 期に入る閾値濃度は、細胞がすでに間期を抜けた後に M 期の活性を維持できる最小濃度よりも高くなります。
科学者は、G2/M 遷移の双安定性を理論的にも経験的にも検証しています。ノヴァック-タイソン モデルは、サイクリン B/CDK1-cdc25-Wee1-Myt1 フィードバック ループをモデル化する微分方程式が、サイクリン B 濃度の範囲にわたって 2 つの安定した平衡を許容することを示しています。[9]実験的には、内因性サイクリン B1 合成を阻害し、さまざまな濃度の非分解性サイクリン B1 で間期および M 期の細胞を滴定することによって双安定性が検証されています。これらの実験では、M 期に入る閾値濃度が M 期から出る閾値よりも高いことが示されています。間期から出る細胞では、サイクリン B1 が 32-40 nm の間で核膜の崩壊が起こりますが、すでに M 期にある細胞では、16-24 nm を超える濃度では核が崩壊したままです。[10]
この双安定性のヒステリシススイッチは、少なくとも3つの理由で生理学的に必要です。[11]まず、G2/M 遷移は、染色体凝縮や核膜崩壊などのいくつかのイベントの開始を知らせます。これらのイベントは細胞の形態を著しく変化させ、分裂細胞でのみ実行可能です。したがって、サイクリン B1/CDK1 活性化がスイッチのように発生することが不可欠です。つまり、細胞は遷移後に個別の M 期状態に急速に落ち着き、中間状態の連続体 (たとえば、部分的に分解した核膜) にとどまらない必要があります。この要件は、CDK1 活性の間期と M 期の平衡レベルを分ける明確な不連続性によって満たされます。サイクリン B 濃度が活性化閾値を超えて増加すると、細胞は急速に M 期の平衡状態に切り替わります。
第二に、G2/M 遷移が一方向に、つまり細胞周期ごとに 1 回だけ発生することも重要です。生物系は本質的にノイズが多く、G2/M 遷移の閾値付近でのサイクリン B1 濃度の小さな変動によって、細胞が間期と M 期の状態を行き来することはありません。これは、スイッチの双安定性によって保証されます。細胞が M 期状態に移行した後、サイクリン B の濃度がわずかに減少しても、細胞が間期に戻ることはありません。
最後に、細胞周期の継続には、細胞とその子孫がM期に移行したりM期から移行したりする際に、サイクリンB/CDK1活性の持続的な振動が必要です。負のフィードバックは、この長期振動の重要な要素の1つを提供します。サイクリンB/CDKはAPC/Cを活性化し、それが中期以降サイクリンBの分解を引き起こし、CDK1を不活性状態に戻します。ただし、単純な負のフィードバックループは減衰振動を引き起こし、最終的には定常状態に落ち着きます。運動モデルは、双安定正のフィードバックモチーフと結合した負のフィードバックループが、長期の細胞周期に必要な種類の持続的で減衰しない振動（緩和振動子を参照）につながる可能性があることを示しています。
肯定的なフィードバック
サイクリン B1/CDK1 が Wee1 と Myst1 を阻害し、cdc25 を活性化することで自身の活性化を促進する上記の正のフィードバック ループには、フィードバック ループを開始するための「トリガー」メカニズムが本質的には含まれていません。最近、このスイッチの開始を制御する上でサイクリン A2 /CDK 複合体がより重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が出てきました。サイクリン A2/ CDK2 の活性は S 期初期に始まり、G 2期に増加します。Cdc25B は、前述の CDK1 メカニズムと同様に、G 2 期初期から中期に CDK2 の Tyr15 を脱リン酸化することが示されています。U2OS 細胞でのサイクリン A2 のダウンレギュレーションは、Wee1 活性を増加させ、Plk1 と Cdc25C 活性を低下させることで、サイクリン B1/CDK1 の活性化を遅らせます。しかし、サイクリン A2/CDK 複合体は、厳密には G 2期におけるサイクリン B1/CDK1 の活性化因子として機能するわけではない。CDK2 は、おそらくCdc6の安定化リン酸化を介して、 p53 非依存性 G 2期チェックポイント活性の活性化に必要であることが示されているからである。CDK2-/- 細胞はまた、異常に高いレベルの Cdc25A を有する。サイクリン A2/CDK1 は、Cdc25B のプロテアソーム破壊を媒介することも示されている。これらの経路は、癌ではしばしば調節不全になる。[7]
空間規制
サイクリン B1-CDK1 活性化の双安定性およびヒステリシスの側面に加えて、細胞内タンパク質局在の調節も G2/M 遷移に寄与します。不活性なサイクリン B1-CDK1 は細胞質に蓄積し、細胞質 cdc25 によって活性化され始め、その後前期に急速に核に隔離されます (さらに活性化されるにつれて)。哺乳類では、サイクリン B1/CDK1 の核への移行は、サイクリンB1の細胞質保持部位 (CRS) にある 5 つのセリン部位 (S116、S26、S128、S133、および S147)のリン酸化によって活性化されます。アフリカツメガエルでは、サイクリン B1 には 4 つの類似の CRS セリンリン酸化部位 (S94、S96、S101、および S113) が含まれており、このメカニズムが高度に保存されていることを示しています。核外輸送は、サイクリン B1 の核外輸送シグナル(NES)のリン酸化によっても不活性化されます。これらのリン酸化部位の調節因子はまだほとんどわかっていませんが、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)、PLK1、CDK1 自体など、いくつかの因子が特定されています。リン酸化がある閾値レベルに達すると、サイクリン B1/CDK1 の核への移行は極めて迅速です。核内に入ると、サイクリン B1/CDK1 は、ヒストン H1、核ラミン、中心体タンパク質、微小管関連タンパク質 (MAP)など、有糸分裂に備えて多くの標的をリン酸化します。
cdc25 の細胞内局在も前期に細胞質から核へと移行する。これは核局在配列 (NLS) を不明瞭にするリン酸の除去と核外輸送シグナルのリン酸化によって達成される。cdc25 とサイクリン B1/CDK1 が同時に核内に輸送されると、タンパク質の有効濃度が上昇し、スイッチのような移行特性が増幅されると考えられている。[7]
G2/M DNA損傷の停止
細胞は、G2期のDNA損傷や不完全に複製された染色体に対して、損傷した染色体を分離しようとするのを防ぐため、G2/M期の移行を遅らせることで反応する。DNA損傷はキナーゼATMとATRによって検出され、Cdc25の阻害キナーゼであるChk1を活性化する。Chk1はCdc25の活性を直接的に阻害し、核からの排除を促進することでも阻害する。 [7]最終的な効果は、M期へのヒステリシス遷移を開始するために必要なサイクリンB1の閾値の増加であり、相同組換え修復などのメカニズムによって損傷が修復されるまで、細胞をG2期で効果的に停止させる（上記参照）。[4]
G2 期停止の長期維持は、 DNA 損傷に応じて安定化するp53によっても媒介される。 CDK1 は、 p53 の 3 つの転写標的であるp21、Gadd45、および14-3-3σによって直接阻害される。 不活性なサイクリン B1/CDK1 は p21 によって核内に隔離され、[12]活性なサイクリン B1/CDK1 複合体は 14-3-3σ によって細胞質内に隔離される。[13] Gadd45 は、 CDK1 と直接相互作用することにより、サイクリン B1 と CDK1 の結合を阻害する。 p53 も CDK1 の転写を直接抑制する。[13] [14]
医学的関連性
G2/M期移行に関与するいくつかの遺伝子の変異は、多くの癌に関係している。サイクリンBとCDK1の過剰発現は、多くの場合p53などの腫瘍抑制因子の喪失の下流で起こり、細胞増殖の増加を引き起こす可能性がある。 [7]これらの変化を緩和するための実験的アプローチには、CDK1の薬理学的阻害とサイクリンB1発現のダウンレギュレーション（例： siRNA経由）の両方が含まれる。[15] [16]
化学療法への応用を目的としたG2/M移行の調整の試みは、DNA損傷チェックポイントに焦点を当てている。Chk1阻害によるG2/Mチェックポイントの薬理学的バイパスは、他の化学療法薬の細胞毒性を高めることがわかっている。チェックポイントのバイパスは、有害な変異の急速な蓄積につながり、癌細胞をアポトーシスに導くと考えられている。逆に、G2/M停止を延長する試みは、ドキソルビシンなどの薬剤の細胞毒性を高めることもわかっている。これらのアプローチは、臨床および前臨床研究段階にある。[17]
参考文献
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