DNAアノテーション

構造アノテーションの最初のステップは、低複雑性配列（AGAGAGAG や TTTTTTTTT のようなモノポリマーセグメントなど）やトランスポゾン（ゲノム全体に複数のコピーを持つより大きな要素）を含む反復配列の識別とマスキングです。 ^{[ 2 ] [ 24 ]}反復配列は、原核生物と真核生物のゲノムの両方の主要な構成要素です。たとえば、原核生物のゲノムの 0% から 42% 以上が反復配列で構成されており^{[ 25 ]} 、ヒトゲノムの 4 分の 3 は反復要素で構成されています。^{[ 26 ]}

反復配列の特定は、主に 2 つの理由から困難です。1 つは保存性が低く、境界が明確に定義されていないことです。このため、対象となるゲノムの反復配列ライブラリを構築する必要があり、これは次のいずれかの方法で実行できます。^{[ 24 ] [ 27 ]}

• デノボ法。反復配列は、自己ゲノム比較において配列保存の最小閾値を超える類似性を持つ異なる位置の配列ペアを検出してグループ化することによって特定されるため、反復構造や配列に関する事前情報は必要ありません。これらの方法の欠点は、トランスポゾンだけでなくあらゆる反復配列を特定でき、保存されたコーディング配列（CDS）が含まれる可能性があるため、これらの配列を除去するために慎重な後処理が不可欠なステップとなることです。また、時間の経過とともに劣化してきた関連領域が除外されたり、進化の歴史において関連性のない要素がグループ化されたりする可能性もあります。 ^{[ 28 ]}
• 相同性に基づく方法。反復配列は、厳選されたデータベースに保存されている既知の反復配列との類似性（相同性）に基づいて同定されます。これらの方法は、 de novo法と比較して、たとえ少量であっても実際のトランスポゾンを発見できる可能性が高くなりますが、既に同定されているファミリーに偏りがあります。
• 構造に基づく手法。反復配列は、反復回数や類似性ではなく、その構造モデルに基づいて識別されます。相同性に基づく手法と同様に、実際のトランスポゾンを識別することが可能ですが、既知の要素によるバイアスを受けません。ただし、各反復配列の種類に非常に特異性が高いため、汎用性は低くなります。
• 比較ゲノム解析法。反復配列は、大きな挿入領域によって生成される多重配列アライメントにおいて、1つ以上の配列が分断された部分として同定される。この手法は、他の手法に存在する境界が不明確な問題を回避できるものの、アセンブリの品質と対象ゲノムにおけるトランスポゾンの活性レベルに大きく依存する。

ゲノム内の反復領域が特定された後、それらはマスキングされます。マスキングとは、ヌクレオチドの文字（A、C、G、またはT）を他の文字に置き換えることを意味します。そうすることで、これらの領域は反復領域としてマークされ、下流の解析ではそれに応じて処理されます。反復領域は、マスキングしないとパフォーマンスの問題を引き起こす可能性があり、遺伝子アノテーションの誤った証拠を生み出す可能性さえあります（たとえば、トランスポゾン内のオープンリーディングフレーム（ORF）をエクソンとして扱うなど）^{[ 24 ]。}置換に使用される文字に応じて、マスキングはソフトマスキングまたはハードマスキングに分類できます。ソフトマスキングでは、反復領域は小文字（a、c、g、またはt）で示されますが、ハードマスキングでは、これらの領域の文字はNに置き換えられます。このようにして、たとえば、ソフトマスキングは単語の一致を除外し、これらの領域でのアライメントの開始を回避するために使用でき、ハードマスキングは、これらすべてに加えて、マスキングされた領域をアライメントスコアから除外することもできます。^{[ 29 ] [ 30 ]}

ゲノムマスキングの次のステップは通常、利用可能なすべての転写産物とタンパク質の証拠を解析対象のゲノムにアラインメントすること、つまり、注釈付け対象の生物の既知のすべての発現配列タグ（EST）、RNA、およびタンパク質をゲノムにアラインメントすることです。^{[ 31 ]}これはオプションですが、RNAとタンパク質はコーディング配列の直接の産物であるため、遺伝子配列の解明を改善できます。^{[ 19 ]}

RNA-Seqデータが利用可能な場合は、対応するゲノムに存在するすべての遺伝子とそのアイソフォームを注釈付けおよび定量化するために使用でき、それらの位置だけでなく発現率も提供できます。 ^{[ 32 ]}しかし、転写産物は、一部の遺伝子から得られない場合や、複数の遺伝子のオペロンをコードしている場合、フレームシフトや翻訳開始因子により開始コドンと終止コドンを決定できない場合があるため、遺伝子予測には不十分な情報しか提供しません。^{[ 19 ]}この問題を解決するために、質量分析から得られることが多い発現タンパク質からの情報を利用するプロテオゲノミクスベースのアプローチが採用されています。^{[ 33 ]}

真核生物ゲノムの注釈付けには、RNAスプライシングという転写後プロセスによってさらに困難が加わります。このプロセスでは、イントロン（非コード領域）が除去され、エクソン（コード領域）が結合されます。^{[ 23 ]}そのため、真核生物のコード配列（CDS）は不連続であり、正しく識別するためには、イントロン領域をフィルタリングする必要があります。そのためには、注釈付けパイプラインでエクソンとイントロンの境界を見つける必要があり、この目的のために複数の手法が開発されています。1つの解決策は、既知のエクソン境界をアライメントに使用することです。たとえば、多くのイントロンはGTで始まり、AGで終わります。^{[ 31 ]}ただし、このアプローチでは新しい境界を検出できないため、既知のエクソン境界と品質情報に基づいてトレーニングされた機械学習アルゴリズムなどの代替手段が存在し、新しい境界を予測します。^{[ 34 ]}新しいエクソン境界の予測ツールは通常、効率的なデータ圧縮およびアライメントアルゴリズムを必要としますが、シーケンスカバレッジが低い領域やシーケンス中に発生するエラー率が高い領域にある境界では失敗しやすいです。 ^{[ 35 ] [ 36 ]}

ゲノムはコーディング領域と非コーディング領域に分けられ、構造アノテーションの最終段階は、ゲノム内のこれらの特徴を識別することです。実際、ゲノムアノテーションの主なタスクは遺伝子予測であり、そのため、この目的のために多数の方法が開発されてきました。^{[ 19 ]}遺伝子予測は誤解を招く用語です。ほとんどの遺伝子予測ツールはコーディング配列（CDS）のみを識別し、非翻訳領域（UTR）を報告しないためです。このため、CDS予測がより正確な用語として提案されています。^{[ 24 ]} CDS予測ツールは、センサーと呼ばれる方法によってゲノムの特徴を検出します。センサーには、プロモーターやポリAサイトなどの機能部位シグナルを識別するシグナルセンサーと、DNA配列をコーディングコンテンツと非コーディングコンテンツに分類するコンテンツセンサーが含まれます。 ^{[ 37 ]}原核生物のCDS予測ツールは主に開始コドンと終止コドンの間のDNAセグメントであるオープンリーディングフレーム（ORF）を扱いますが、真核生物のCDS予測ツールは、真核生物の遺伝子の複雑な構成のために、より困難な問題に直面しています。^{[ 3 ]} CDS予測方法は大きく3つのカテゴリーに分類できます。^{[ 2 ] [ 31 ]}

• アブイニシオ法（統計的、内在的、またはデノボとも呼ばれる）。CDS予測は、DNA配列から抽出できる情報のみに基づいている。これらの方法は、隠れマルコフモデル（HMM）などの統計的手法に依存している。一部の手法では、2つ以上のゲノムを使用して、ゲノムに沿った局所的な突然変異率とパターンを推測する。 ^{[ 38 ]}
• 相同性に基づく手法（経験的、証拠駆動型、または外因的とも呼ばれる）。CDS予測は、既知の配列との類似性に基づいて行われます。具体的には、解析対象の配列を、発現​​配列タグ（EST）、相補的DNA（cDNA）、またはタンパク質配列とアライメントします。
• コンバイナー。CDS予測は、上記2つの方法を組み合わせて行われます。

遺伝子の機能アノテーションには、予測される機能的特徴に名前を付けるための統制語彙（またはオントロジー）が必要です。しかし、遺伝子機能を定義する方法は多数あるため、異なる研究グループによってアノテーションプロセスが実行されると、プロセスが妨げられる可能性があります。そのため、標準化された統制語彙を使用する必要があり、その中で最も包括的なのがGene Ontology（GO）です。GOは、機能特性を3つのカテゴリ（分子機能、生物学的プロセス、細胞構成要素）のいずれかに分類し、それらを有向非巡回グラフに整理します。このグラフでは、各ノードが特定の機能であり、2つのノード間の各エッジ（または矢印）は、親子関係またはサブカテゴリ-カテゴリ関係を示します。^{[ 40 ] [ 41 ]} 2020年現在、GOは遺伝子の機能アノテーションで最も広く使用されている統制語彙であり、MIPS Functional Catalog（FunCat）がそれに続きます。^{[ 42 ]}

機能アノテーションの従来の方法には、局所アラインメント検索ツールに依存する相同性に基づくものがあります。^{[ 40 ]}その前提は、2 つのゲノム要素間の配列保存性が高いということは、その機能も保存されていることを意味するということです。パラロジー、オルソロジー、またはゼノロジーによって出現した相同配列のペアは、通常、同様の機能を果たします。ただし、オルソロジー配列は、次の 2 つの理由から慎重に扱う必要があります。(1) 最初にアノテーションされた時期によって名前が異なる可能性があること、(2) 2 つの異なる生物で同じ機能的役割を果たさない可能性があること。アノテーターは、パラロジー、オルソロジー、またはゼノロジーが見つからなかった場合、類似配列を参照することがよくあります。 ^{[ 19 ]}相同性に基づく方法には、データベースのエラー、感度/特異性の低さ、パラロジーと相同性を区別できないこと、^{[ 43 ]}低複雑性領域の存在による人為的に高いスコア、およびタンパク質ファミリー内の大きな変動など、いくつかの欠点があります。^{[ 44 ]}

機能アノテーションは確率的手法によって実行できます。親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の分布は、タンパク質が溶液中にあるか膜中にあるかを示します。特定の配列モチーフは、翻訳後修飾と特定のタンパク質の最終的な位置に関する情報を提供します。 ^{[ 19 ]}確率的手法は、GOなどの統制語彙と組み合わせることができます。たとえば、タンパク質間相互作用（PPI）ネットワークでは、通常、類似の機能を持つタンパク質が互いに近くに配置されます。^{[ 45 ]}

機械学習法は、GO用語に基づいて新規タンパク質の機能アノテーションを生成するためにも使用されます。一般的に、各GO用語に対してバイナリ分類器を構築し、それらを結合して個々のGO用語の予測を行い（多クラス分類器を形成）、その後信頼度スコアを取得します。サポートベクターマシン（SVM）は、機能アノテーションで最も広く使用されているバイナリ分類器ですが、k近傍法（kNN）や畳み込みニューラルネットワーク（CNN）などの他のアルゴリズムも使用されています。^{[ 40 ]}

機能アノテーションのための二値分類法や多クラス分類法は、GO用語間の相互関係を考慮しないため、一般的に精度が低い結果をもたらします。これらの相互関係を考慮するより高度な方法は、フラットなアプローチまたは階層的なアプローチのいずれかによって行われますが、前者はオントロジー構造を考慮しないのに対し、後者は考慮するという点で区別されます。これらの方法の中には、行列分解やハッシュ化によってGO用語を圧縮し、パフォーマンスを向上させるものもあります。^{[ 42 ]}

非コード配列（ncDNA）は、タンパク質をコードしない配列です。これには、偽遺伝子、セグメント重複、結合部位、RNA遺伝子などの要素が含まれます。^{[ 28 ]}

偽遺伝子は、オープンリーディングフレーム（ORF）の破壊によりコード機能を失い、翻訳不可能になったタンパク質コード遺伝子の変異コピーである。^{[ 28 ]}これらは、次の2つの方法のいずれかを使用して識別される可能性がある。^{[ 46 ]}

• 相同性に基づく方法。偽遺伝子は、機能遺伝子に類似しているが、ORFに破壊をもたらす変異を含む配列を検索することによって同定される。この方法では、偽遺伝子とその親遺伝子との進化的な関係や、その事象が発生してから経過した時間を特定できない。
• 系統発生に基づく方法。偽遺伝子は系統発生解析によって同定されます。まず、対象種の種系統樹と対象遺伝子（または遺伝子ファミリー）の系統樹を作成します。次に、この2つを比較して、遺伝子を失った種を特定します。続いて、遺伝子が見つからなかった種のゲノム内で、最も近縁な種で同定された遺伝子と相同な配列を検索します。最後に、この相同配列のORFに欠失があり（かつRNA-Seqデータ解析、dN/dS比などの他の基準も満たす場合）、その配列は偽遺伝子であると判断されます。

セグメント重複とは、1000塩基対を超えるDNAセグメントで、ゲノム内で90%以上の配列同一性で繰り返されているものです。セグメント重複の識別に使用される2つの戦略は、WGACとWSSDです。^{[ 47 ]}

• 全ゲノムアセンブリ比較（WGAC）。これは、共通の反復配列を除外した後、ゲノム全体を自身にアラインメントして反復配列を特定する手法です。アセンブリに使用した元のリードは必要ありません。
• 全ゲノムショットガンシーケンス検出（WSSD）。これは、元のリードをアセンブルされたゲノムにアラインメントし、平均よりもリード深度が高い領域を検索します。これは通常、重複のシグナルです。この方法で特定されたがWGACでは特定されなかったセグメント重複は、おそらく重複が崩壊したものであり、誤って同じ領域にアラインメントされたことを意味します。^{[ 48 ]}

DNA結合部位は、ゲノム配列の中で特定のタンパク質と結合して相互作用する領域です。DNA複製と修復、転写調節、ウイルス感染において重要な役割を果たします。結合部位の予測には、次の2つの方法のいずれかが使用されます。^{[ 49 ]}

• 配列類似性に基づく手法。これは、既知のDNA結合部位を持つ相同配列を特定するか、クエリタンパク質と配列をアラインメントすることによって行われます。DNA結合配列は保存性が低いため、これらの手法の性能は通常低くなります。
• 構造に基づく手法。タンパク質の三次元構造情報を用いて、DNA結合部位の位置を予測する。

RNA遺伝子によって生成される非コードRNA（ncRNA）は、タンパク質に翻訳されないRNAの一種です。これには、tRNA、rRNA、snoRNA、マイクロRNAなどの分子や、非コードmRNA様転写産物が含まれます。単一ゲノムにおけるRNA遺伝子のab initio予測は、多くの場合不正確な結果をもたらすため（miRNAは例外）、代わりにマルチゲノム比較法が使用されます。これらの方法は、ncRNAの二次構造に特に関心があり、配列が保存されていなくても、関連種間で保存されています。したがって、多重配列アライメントを実行することで、予測に役立つより有用な情報を得ることができます。相同性検索もRNA遺伝子の同定に使用できますが、この手順は、特に真核生物では、多数の反復配列や偽遺伝子の存在により複雑です。^{[ 50 ]}

ゲノムブラウザでの注釈の可視化には、各注釈のイントロン-エクソン構造、開始コドンと終止コドン、UTR、代替転写産物を記述し、理想的には各遺伝子モデルをサポートする配列アライメントと遺伝子予測に関する情報を含む記述出力ファイルが必要です。注釈を記述するためによく使用される形式には、GenBank、GFF3、GTF、BED、EMBLなどがあります。^{[ 24 ]}これらの形式の中には、記述用語を定義し、解析ツールと可視化ツール間の相互運用性を保証するために、統制語彙とオントロジーを使用するものがあります。^{[ 2 ]}

ゲノムブラウザは、グラフィカルインターフェースを介して、大規模なゲノム配列および注釈データの分析と視覚化を簡素化し、生物学的洞察を得るためのソフトウェア製品です。^{[ 52 ] [ 31 ] [ 53 ]}

ゲノムブラウザは、ウェブベースのゲノムブラウザとスタンドアロンのゲノムブラウザに分類できます。前者はデータベースの情報を使用し、複数種（複数の生物の配列と注釈を統合し、種間比較分析を促進する）と種特異的（1つの生物と特定の種の注釈に焦点を当てる）に分類できます。後者は必ずしも特定のゲノムデータベースにリンクされているわけではなく、ローカルコンピュータにアプリケーションとしてダウンロードしてインストールできる汎用ブラウザです。^{[ 54 ] [ 19 ]}

比較ゲノミクスは、ゲノムの特徴の類似点と相違点を特定するとともに、生物間の進化関係を調べることを目的としています。^{[ 55 ]} 2つ以上のゲノム間の比較挙動を視覚化できるツールは、このアプローチに不可欠であり、比較対象のゲノム間の関係の表現に基づいて3つのカテゴリに分類できます。^{[ 19 ]}

• ドットプロット：この方式では、2つのゲノムのアライメントのみを表示できます。一方のゲノムは水平軸に沿って、もう一方のゲノムは垂直軸に沿って表示され、プロット内のドットは、これら2つのアノテーション間で類似しているゲノム要素を表します。
• 線形表現：この表現では、複数の線形トラックを使用して複数のゲノムとその特徴を表します。ここで「トラック」とは、ゲノム上の特定の位置にある特定の種類のゲノム特徴を指す概念です。
• 円形表示：この表示方法は、微生物またはウイルスのゲノム全体を比較するのに役立ちます。この表示モードでは、同心円と円弧を使用してゲノムの各部分を表します。

アノテーションプロジェクトは、多くの場合、生物のゲノムの以前のアノテーションに依存していますが、これらの古いアノテーションには、新しいアノテーションに伝播する可能性のあるエラーが含まれている場合があります。新しいゲノム解析技術が開発され、より豊富なデータベースが利用可能になると、古いゲノムのアノテーションが更新されることがあります。再アノテーションとして知られるこのプロセスは、遺伝子やタンパク質の機能の詳細など、ゲノムに関する新しい情報をユーザーに提供できます。したがって、再アノテーションは品質管理において有用なアプローチです。^{[ 56 ] [ 58 ]}

遺伝子オントロジーは、疾患と遺伝子の関係を確立するために研究者によって使用されています。GO は、病気と健康など、さまざまな条件下での新規遺伝子、その発現、分布、機能の変化の特定に役立ちます。^{[ 41 ]} さまざまな生物のこの疾患と遺伝子の関係のデータベースが作成されており、例えば、植物病原体オントロジー^{[ 64 ]} 、植物関連微生物遺伝子オントロジー^{[ 65 ] 、または DisGeNET [ 66 ]}などがあります。また、ラットゲノムデータベースのラット疾患オントロジー^{[ 67 ]}のように、既存のデータベースに実装されているものもあります。

一部の細菌株による炭化水素分解に関与する多様な異化酵素は、可動遺伝因子（MGE）に存在する遺伝子によってコードされている。これらの因子の研究は、バイオレメディエーションの分野で非常に重要である。なぜなら、最近では、これらの炭化水素分解能力を獲得するために、野生株または遺伝子組み換え株にこれらのMGEを接種することが試みられているからである。^{[ 68 ]} 2013年、Phaleら^{[ 69 ]}は、炭素源およびエネルギー源としてグルコースよりもナフタレンやその他の芳香族化合物を好むことで知られる細菌であるPseudomonas putida （CSV86）株のゲノム注釈を発表した。この細菌のMGEを見つけるために、RASTとNCBI原核生物ゲノム注釈パイプライン（PGAP）を使用してゲノムが注釈付けされ、挿入配列（IS）ファインダーデータベースを使用して9つの可動因子の同定が可能になった。この分析の結果、ナフタレン分解の上流経路遺伝子がtRNA-Glyおよびインテグラーゼをコードする遺伝子のすぐ隣に位置することが明らかになり^{[ 70 ]} 、サリチル酸、安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸の分解に関与する酵素をコードする遺伝子が同定され、この株におけるグルコース輸送に関与するオペロンが認識されました。

遺伝子オントロジー解析は機能アノテーションにおいて非常に重要であり、特にバイオレメディエーションにおいては、微生物の遺伝子とそれらの機能、および特定の汚染物質の修復におけるそれらの役割との関係を知るために応用できます。これは、特に亜鉛などの重金属に対する耐性をコードする31個の遺伝子を持つ細菌であるHalomonas zincidurans株B6(T) ^{[ 71 ]}や、 DDTを唯一の炭素源およびエネルギー源として利用できる株であるStenotrophomonas sp. DDT-1 ^{[ 72 ]}の調査および同定のアプローチでした。