シーケンスアセンブリ

バイオインフォマティクス において、配列アセンブリとは、長いDNA配列の断片を整列させて結合し、元の配列を再構築することを指します。 ^[1] DNAシーケンシング技術では、ゲノム全体を一度に「読み取る」ことはできず、使用する技術に応じて20〜30,000塩基の小さな断片を読み取る必要があるため、これが必要になります。 ^[1]通常、短い断片（読み取り）は、ゲノムDNAまたは遺伝子転写産物（EST ）のショットガンシーケンシングから得られます。^[1]

シーケンスの組み立ての問題は、本のコピーを何冊も取り、それぞれを異なるカッターを備えたシュレッダーに通し、細断された断片を見るだけで本のテキストをつなぎ合わせることに例えることができます。この作業の明らかな難しさに加えて、いくつかの実用的な問題があります。オリジナルには多くの段落が繰り返されている可能性があり、細断中に一部の断片が修正されてタイプミスが生じる可能性があります。別の本からの抜粋が追加される可能性があり、一部の断片はまったく認識できない可能性があります。

シーケンス データを組み立てるには、次の 3 つのアプローチがあります。

1. デノボ：テンプレートを使用せずに、シーケンスリードを組み立てて全長（場合によっては新規）シーケンスを作成する（デノボシーケンスアセンブラ、デノボトランスクリプトームアセンブリを参照）^[2]
2. マッピング/アライメント: 読み取りをテンプレート (別名参照) に対してアライメントすることで読み取りを組み立てます。組み立てられたコンセンサスはテンプレートと同一ではない場合があります。
3. 参照ガイド: 参照内の最も類似した領域との類似性によってリードをグループ化します (段階的なマッピング)。各グループ内のリードは、短いリードの品質を模倣するために短縮されます。これを行うための一般的な方法は、k-merアプローチです。参照ガイドアセンブリは、長いリードを使用する場合に最も便利です。^[3]

参照ガイドアセンブリは、他のタイプの組み合わせです。このタイプは、長い読み取りに適用され、短い読み取りの利点 (つまり、コール品質) を模倣します。その背後にあるロジックは、参照内のより小さなウィンドウで読み取りをグループ化することです。次に、各グループの読み取りは、k-mere アプローチを使用してサイズが縮小され、最高品質で最も連続している可能性の高い (コンティグ) を選択します。次に、コンティグが結合されてスキャフォールドが作成されます。最終的なコンセンスは、スキャフォールドのギャップを閉じることによって作成されます。

最初の配列アセンブラは、DNAシーケンサーと呼ばれる自動配列解析装置によって生成された膨大な量の断片をつなぎ合わせるための、より単純な配列アライメントプログラムのバリエーションとして、1980年代後半から1990年代初頭に登場し始めました。^[2]配列解析された生物のサイズと複雑さが増すにつれて（小さなウイルスからプラスミド、細菌、そして最終的には真核生物）、これらのゲノムプロジェクトで使用されるアセンブリプログラムには、次のものを処理するためのますます洗練された戦略が必要になりました。

• コンピューティング クラスターで処理する必要がある数テラバイトのシーケンス データ。
• 最悪の場合、アルゴリズムの時間と空間の複雑さが 2 乗的に増加する可能性がある、同一またはほぼ同一のシーケンス (繰り返しとして知られています)。
• シーケンシング機器からの断片内のDNA 読み取りエラーにより、アセンブリが混乱する可能性があります。

最初のより大きな真核生物ゲノム（2000年のショウジョウバエDrosophila melanogasterとそのわずか1年後のヒトゲノム）をアセンブルするという課題に直面した科学者たちは、1億3千万（ショウジョウバエD. melanogasterなど）から30億（ヒトゲノムなど）の塩基対のゲノムを処理できるCelera Assembler ^[4]やArachne ^[5]などのアセンブラーを開発しました。これらの取り組みに続いて、主に主要なゲノムシーケンシングセンターのいくつかのグループが大規模なアセンブラーを構築し、ゲノムアセンブリ技術のすべてのイノベーションをオープンソースフレームワークの下に統合するAMOS ^[6]と呼ばれるオープンソースの取り組みが開始されました。

発現配列タグまたはESTアセンブリは、1990年代半ばから2000年代半ばにかけて、ゲノム全体ではなく個々の遺伝子をアセンブルするための初期の戦略でした。^[7]この問題は、ゲノムアセンブリとはいくつかの点で異なります。ESTアセンブリの入力配列は、細胞の転写されたmRNAの断片であり、ゲノム全体のサブセットのみを表します。 ^[7]ゲノムアセンブリとESTアセンブリでは、アルゴリズム上の問題がいくつか異なります。たとえば、ゲノムには、遺伝子間領域に集中している大量の反復配列が含まれることがよくあります。転写された遺伝子には反復がはるかに少ないため、アセンブリは多少簡単になります。一方、一部の遺伝子は非常に多く発現（転写）されるため（ハウスキーピング遺伝子など）、全ゲノムショットガンシーケンシングとは異なり、リードはゲノム全体で均一にサンプリングされません。

EST アセンブリは、（シス）選択的スプライシング、トランススプライシング、一塩基多型、転写後修飾などの特徴によって、はるかに複雑になります。2008 年にRNA-Seqが発明されて以来、EST シーケンシングは、 de novo トランスクリプトームアセンブリで説明されている、このはるかに効率的な技術に置き換えられました。

複雑さと時間要件の点では、de-novoアセンブリはマッピングアセンブリよりも桁違いに遅く、メモリを大量に消費します。これは主に、アセンブリアルゴリズムがすべての読み取りを他のすべての読み取りと比較する必要があるためです（単純な時間計算量はO( n2 )です）。現在のde-novoゲノムアセンブラは、次のようなさまざまな種類のグラフベースのアルゴリズムを使用しています。 [ ^{8 ]}

• オーバーラップ/レイアウト/コンセンサス(OLC) アプローチは、サンガー データ アセンブラに典型的であり、オーバーラップ グラフに依存します。
• de Bruijn Graph (DBG) アプローチは、Solexa および SOLiD プラットフォームからのショート リードに最も広く適用されています。これは、大量のショート リードで優れたパフォーマンスを発揮する K-mer グラフに依存しています。
• 貪欲グラフベースのアプローチ。OLCまたはDBGアプローチのいずれかを使用することもできます。貪欲グラフベースのアルゴリズムでは、コンティグ（一緒に整列された一連のリード^{[さらに説明が必要]）}は貪欲拡張によって成長し、常に最高スコアのオーバーラップをたどって見つかったリードを採用します。^[3]

序文でシュレッダーにかけた本との比較について言及すると、アセンブリのマッピングでは、テンプレートとして非常によく似た本（おそらく主要人物の名前といくつかの場所が変更されている）を使用しますが、デノボアセンブリでは、これが科学書になるのか、小説になるのか、カタログになるのか、あるいは複数の本になるのか事前にわからないため、より困難な課題となります。また、すべてのシュレッダーは、他のすべてのシュレッダーと比較されます。

デノボアセンブリで繰り返しを処理するには、隣接する繰り返しを表すグラフを構築する必要があります。このような情報は、繰り返し全体またはその両端のみをカバーする長いフラグメントを読み取ることで取得できます。一方、マッピングアセンブリでは、複数の一致または一致がない部分は通常、別のアセンブリ手法で調べるために残されます。^[3]

シーケンス アセンブリの複雑さは、フラグメントの数とその長さという 2 つの主な要因によって決まります。フラグメントの数と長さは、シーケンスの重複をより適切に識別できる一方で、基礎となるアルゴリズムがフラグメントの数と長さの両方に対して 2 乗または指数関数的な複雑さの動作を示すため、問題も生じます。また、シーケンスが短いほどアラインメントが速くなりますが、短い読み取りは繰り返しやほぼ同一の繰り返しで使用するのが難しくなるため、アセンブリのレイアウト フェーズも複雑になります。

DNA 配列解析の初期の頃、科学者は研究室で数週間かけて作業した後でも、短い長さ (数十塩基程度) の配列を数個しか得ることができませんでした。そのため、これらの配列は手作業で数分で整列させることができました。

1975年にジデオキシ終結法（別名サンガーシーケンシング）が発明され、2000年を少し過ぎた頃には、この技術は完全に自動化された機械が24時間体制で高度に並列化されたモードでシーケンスを大量処理できるレベルまで改善されました。世界中の大規模なゲノムセンターには、これらのシーケンシングマシンの完全なファームが収容されており、その結果、読み取りが 全ゲノムショットガンシーケンシングプロジェクトのシーケンスに最適化したアセンブラが必要になりました。

• 約800～900塩基長である
• シーケンシングおよびクローニングベクターなどのシーケンシングアーティファクトを含む
• エラー率は0.5～10%

サンガー技術により、20,000 ～ 200,000 の読み取りを持つ細菌プロジェクトを 1 台のコンピューターで簡単に組み立てることができました。約 3,500 万の読み取りを持つヒトゲノムのようなより大規模なプロジェクトには、大規模なコンピューティング ファームと分散コンピューティングが必要でした。

2004年から2005年までには、454 Life Sciencesによってパイロシーケンシングが商業的に実現可能となった。^[9]この新しいシーケンシング方法では、サンガーシーケンシングよりもはるかに短いリードが生成され、当初は約100塩基であったが、現在では400～500塩基となっている。^[9]スループットがはるかに高く、コストが低い（サンガーシーケンシングと比較して）ことから、ゲノムセンターではこの技術の採用が進み、リードセットを効率的に処理できる配列アセンブラーの開発も進んだ。膨大なデータ量と、リード内の技術特有のエラーパターンがアセンブラーの開発を遅らせ、2004年の初めには454のNewblerアセンブラーしか利用できなかった。2007年半ばには、ChevreuxらによるMIRAアセンブラーのハイブリッド版がリリースされた。 [ ^10]は454リードだけでなく454リードとサンガーリードの混合もアセンブルできる最初の無料で利用できるアセンブラでした。異なるシーケンシング技術からの配列をアセンブルすることは、その後ハイブリッドアセンブリと呼ばれるようになりました。^[10]

2006年からは、イルミナ（旧ソレクサ）技術が利用可能になり、1台のシーケンサーで1回の実行あたり約1億回のリードを生成できます。これを、数百台のシーケンサーで生成するのに数年を要したヒトゲノムプロジェクトの3,500万回のリードと比較してください。^[11]イルミナは当初、長さがわずか36塩基に制限されていたため、デノボアセンブリ（デノボトランスクリプトームアセンブリなど）には適していませんでした。しかし、この技術の新しい反復では、3〜400bpのクローンの両端から100塩基を超えるリード長を実現しています。^[11] 2007年末に発表された、DohmらによるSHARCGSアセンブラー^[12]は、ソレクサリードを使用したアセンブリに使用された最初の公開アセンブラーでした。

その後、Applied BiosystemsのSOLiD、Ion Torrent、SMRTなどの新しい技術がリリースされ、新しい技術（例：Nanopore sequencing）が次々と登場しています。これらの技術はエラー率が高いにもかかわらず、読み取り長が長いため繰り返しの問題に対処するのに役立つため、アセンブリにとって重要です。^[11]最大読み取り長よりも長い完全な繰り返しを介してアセンブルすることは不可能ですが、読み取りが長くなるにつれて、その大きさの完全な繰り返しの可能性は小さくなります。これにより、精度が低くても（約85％）、長いシーケンシング読み取りは繰り返しのアセンブルに有利になります。^[11]

ほとんどの配列アセンブラには、 Phredなどの品質管理のためのアルゴリズムが組み込まれています。^[13]しかし、このような尺度では、遺伝子の内容の観点からアセンブリの完全性を評価することはできません。一部のツールは、事後にアセンブリの品質を評価します。

例えば、BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）は、多くの遺伝子がほとんどのゲノムで単一コピー遺伝子としてのみ存在するという事実を利用して、ゲノム、遺伝子セット、またはトランスクリプトームにおける遺伝子の完全性を測る尺度です。 ^[14]初期のBUSCOセットは、脊椎動物では3023個、節足動物では2675個、後生動物では843個、真菌では1438個、真核生物では429個の遺伝子を表していました。この表は、ヒトとショウジョウバエのゲノムの例を示しています。^[14]

生物によってゲノム内にはそれぞれ異なる複雑な領域があります。そのため、異なる計算手法が必要になります。一般的に使用されるアルゴリズムには次のようなものがあります。

• グラフアセンブリ：コンピュータサイエンスにおけるグラフ理論に基づいています。de Bruijn Graphはこのアプローチの一例であり、k-mersを利用して連続したリードを組み立てます。^[15]
• 貪欲グラフアセンブリ: このアプローチでは、アセンブリに追加された各読み取りにスコアを付け、重複領域から可能な限り最高のスコアを選択します。

一連のシーケンスフラグメントが与えられた場合、すべてのフラグメントを含むより長いシーケンスを見つけることが目的です (シーケンスアセンブリの種類の図を参照)。

1. すべてのフラグメントのペアワイズアライメントを計算します。
2. 重なりが最も大きい 2 つのフラグメントを選択します。
3. 選択したフラグメントを結合します。
4. 断片が 1 つだけ残るまで手順 2 と 3 を繰り返します。

結果は問題に対する最適な解決策ではない可能性があります。

一般に、シーケンス リードをスキャフォールドに組み立てるには、次の 3 つの手順があります。

1. 事前アセンブリ: このステップは、バリアント呼び出しや最終的なスキャフォールド配列などの下流分析の整合性を確保するために不可欠です。このステップは、次の 2 つの時系列ワークフローで構成されます。
   1. 品質チェック: シーケンシング技術の種類によっては、誤った塩基呼び出しにつながるさまざまなエラーが発生する可能性があります。たとえば、12 個のアデニンを含む「NAAAAAAAAAAAAN」と「NAAAAAAAAAAAN」のシーケンシングは、誤って 11 個のアデニンで呼び出される可能性があります。ターゲット DNA/RNA の反復性の高いセグメントをシーケンシングすると、1 塩基短くなったり 1 塩基長くなったりする場合があります。読み取り品質は通常、読み取りのシーケンス内の各ヌクレオチド品質のエンコードされたスコアであるPhredによって測定されます。PacBio などの一部のシーケンシング技術には、シーケンスされた読み取りのスコアリング方法がありません。このステップで使用される一般的なツールは FastQC です。^[16]
   2. 読み取りのフィルタリング: 品質チェックに合格しなかった読み取りは、最良のアセンブリ コンティグを取得するためにFASTQファイルから削除する必要があります。
2. アセンブリ: このステップでは、さまざまな基準でリードアライメントを利用して、各リードを可能な位置にマッピングします。リードの予測位置は、そのシーケンスが他のリードまたは参照とどの程度一致するかに基づいています。異なるシーケンシング技術からのリードには、異なるアライメントアルゴリズムが使用されます。アセンブリで一般的に使用されるアプローチには、de Bruijnグラフとオーバーラップがあります。次世代シーケンシングの場合、リードの長さ、カバレッジ、品質、および使用されるシーケンシング技術が、最適なアライメントアルゴリズムを選択する上で重要な役割を果たします。^[17]一方、第 3 世代のシーケンシングリードをアライメントするアルゴリズムでは、それに関連する高いエラー率を考慮するために高度なアプローチが必要です。
3. アセンブリ後: このステップでは、アセンブルされた配列から貴重な情報を抽出することに重点を置いています。比較ゲノミクスや集団分析は、アセンブリ後分析の例です。

de novoアセンブラのリストについては、de novo シーケンス アセンブラを参照してください。マッピング アライナーのリストについては、シーケンス アライメント ソフトウェアのリスト § ショート リード シーケンス アライメントを参照してください。

さまざまな組み立て手順で使用される一般的なツールの一部を次の表に示します。

• デノボ配列アセンブラ
• 配列アライメント
• De novo トランスクリプトーム アセンブリ
• セットカバーの問題
• 配列決定された動物ゲノムのリスト
• 植物ゲノムアセンブリ