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有機化学において、ペプチド合成は、複数のアミノ酸がアミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）を介して連結された化合物であるペプチドの生成である。ペプチドは、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基との縮合反応によって化学的に合成される。さまざまなアミノ酸側鎖との望ましくない副反応を防ぐには、通常、保護基戦略が必要である。[1]化学的ペプチド合成は、最も一般的にはペプチドのカルボキシル末端（C末端）から始まり、アミノ末端（N末端）に向かって進行する。[2]生体内の タンパク質生合成（長いペプチド）は、反対方向に起こる。
ペプチドの化学合成は古典的な溶液相技術を使用して行うことができますが、ほとんどの研究開発環境では固相法に置き換えられています（以下を参照）。[3]溶液相合成は、工業目的でのペプチドの大規模生産においてもその有用性を維持しています。
化学合成により、細菌では発現が難しいペプチドの生成、非天然アミノ酸の組み込み、ペプチド/タンパク質骨格の改変、D-アミノ酸からなるD-タンパク質の合成などが可能になります。
固相合成
研究室で合成ペプチドを製造する確立された方法は、固相ペプチド合成（SPPS）として知られています。[2]ロバート・ブルース・メリフィールドによって開拓され、[4] [5] SPPSは、マクロ的に不溶性の溶媒で膨潤したビーズ状樹脂支持体上でアミノ酸誘導体を連続的に反応させることにより、ペプチド鎖を迅速に組み立てることを可能にします。[要出典]
固体支持体は、新生ペプチド鎖に結合した反応性基（アミン基やヒドロキシル基など）で官能化された小さなポリマー樹脂ビーズで構成されています。[2]ペプチドは合成中ずっと支持体に共有結合したままなので、余分な試薬や副産物は洗浄と濾過によって除去できます。このアプローチは、従来の溶液相合成を使用する場合に必要となる、各反応ステップの後に生成物ペプチドを溶液から分離するという比較的時間のかかる作業を回避します。[要出典]
ペプチド鎖のN末端に結合する各アミノ酸は、側鎖と使用する保護戦略に応じて、 Boc（酸不安定）またはFmoc （塩基不安定）などの適切な保護基を使用して、N末端と側鎖を保護する必要があります（以下を参照）。[1]
一般的な SPPS 手順は、N 末端の脱保護とカップリング反応を交互に繰り返すサイクルの 1 つです。樹脂は各ステップ間で洗浄できます。[2]最初にアミノ酸を樹脂にカップリングします。続いて、アミンを脱保護し、次に追加するアミノ酸の活性化カルボキシル基とカップリングします。このサイクルは、目的の配列が合成されるまで繰り返されます。SPPS サイクルには、未反応のアミノ酸の末端が反応しないようにブロックするキャッピング ステップも含まれる場合があります。合成の最後に、粗ペプチドを固体支持体から切断し、同時にトリフルオロ酢酸などの試薬を使用してすべての保護基を除去します。[2]粗ペプチドは、有機可溶性副産物を除去するために、ジエチルエーテルなどの非極性溶媒から沈殿させることができます。粗ペプチドは、逆相 HPLC を使用して精製できます。[6] [7]精製プロセスは、特に長いペプチドの場合、目的のペプチド製品と同様の特性を持つ多数の微量副産物を累積的に除去する必要があるため、困難になる可能性があります。このため、純度を犠牲にすることなく収率を最大化するために、MCSGPなどのいわゆる連続クロマトグラフィープロセスが商業的にますます使用されるようになっています。 [8]
SPPSは、副産物の指数関数的蓄積による反応収率によって制限され、典型的には70アミノ酸の範囲のペプチドとタンパク質は合成のアクセス可能性の限界に近づいています。 [2]合成の難しさは配列にも依存します。典型的には、アミロイド[9]などの凝集しやすい配列は作成が困難です。より長い長さは、ネイティブ化学ライゲーションなどのライゲーションアプローチを使用することでアクセスでき、2つのより短い完全に脱保護された合成ペプチドを溶液中で結合することができます。
ペプチドカップリング試薬
SPPS の幅広い応用を可能にした重要な特徴は、カップリング段階で極めて高い収率を生み出すことである。[2]非常に効率的なアミド結合形成条件が必要である。特定の合成におけるカップリング収率が最適ではない場合の影響を説明するために、各カップリング段階で少なくとも 99% の収率が得られる場合を考えてみよう。この場合、26 アミノ酸ペプチドの粗収率は全体で 77% となる（各脱保護で 100% の収率を想定）。各カップリングが 95% の効率であれば、全体の収率は 25% となる。[10] [11]そして、各アミノ酸を過剰量（2 倍から 10 倍）添加する。カップリング中のアミノ酸のラセミ化を最小限に抑えることも、最終ペプチド生成物のエピマー化を避けるために極めて重要である。 [要出典]
アミンとカルボン酸の間のアミド結合の形成は遅いため、通常は「カップリング試薬」または「活性剤」が必要になります。特定のカップリングに対する有効性が異なるため、さまざまなカップリング試薬が存在し、[12] [13]これらの試薬の多くは市販されています。
カルボジイミド
ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）やジイソプロピルカルボジイミド（DIC）などのカルボジイミドは、アミド結合の形成によく使用されます。[11]反応は、反応性の高いO-アシルイソ尿素の形成を介して進行します。この反応中間体はペプチドのN末端アミンによって攻撃され、ペプチド結合を形成します。O-アシルイソ尿素の形成は、ジクロロメタンなどの非極性溶媒中で最も速く進行します。[14]
DICは液体なので簡単に分配でき、副産物である尿素も簡単に洗い流せるため、SPPSに特に有用である。逆に、関連するカルボジイミドである1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)は、その尿素副産物を水性ワークアップ中に洗浄することで除去できるため、溶液相ペプチドカップリングによく使用される。[11]
カルボジイミド活性化は、活性化アミノ酸のラセミ化の可能性を開きます。 [11]ラセミ化は、トリアゾール 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）や1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）などの「ラセミ化抑制」添加剤で回避できます。これらの試薬はO-アシルイソ尿素中間体を攻撃して活性エステルを形成し、その後ペプチドと反応して目的のペプチド結合を形成します。[15]カルボジイミドカップリングの添加剤である エチルシアノヒドロキシイミノ酢酸（オキシマ）は、HOAtの代替として機能します。[16]
アミジニウム塩およびホスホニウム塩
カルボジイミド試薬を使用する際に形成される O-アシルイソ尿素中間体を介したエピマー化を避けるために、アミジニウムまたはホスホニウム試薬を使用することができる。これらの試薬は、カルボン酸を脱酸素化する求電子部分 (青) とマスクされた求核部分 (赤) の 2 つの部分からなる。求電子アミジニウムまたはホスホニウム部分に対するカルボン酸の求核攻撃により短寿命の中間体が生成され、これがマスクされていない求核剤によって急速に捕捉され、活性化エステル中間体と尿素またはホスホラミド副産物が形成される。これらのカチオン性試薬には、ヘキサフルオロリン酸またはテトラフルオロホウ酸などの非配位対アニオンがある。[10]このアニオンの正体は、通常、試薬の頭字語の最初の文字で示されるが、命名法は一貫していない場合がある。たとえば、H BTU はヘキサフルオロリン酸塩であるが、T BTU はテトラフルオロホウ酸塩である。HBTUとHATUに加えて、他の一般的な試薬には、 HCTU (6-ClHOBt)、TCFH (塩化物)、COMU (エチルシアノ(ヒドロキシイミノ)アセテート) などがあります。ヒドロキシベンゾトリアゾール部分を組み込んだアミジニウム試薬は、N 型 (グアナジニウム) または O 型 (ウロニウム) で存在できますが、N 型の方が一般的に安定しています。[17]ホスホニウム試薬には、 BOP (HOBt)、PyBOP (HOBt)、PyAOP (HOAt) などがあります。[18]これらの試薬は、カルボジイミド試薬と同じ活性化エステル中間体をもたらしますが、これらのカチオン試薬の高い求電子性により、活性化率は高くなります。[19]アミジニウム試薬はペプチドの N 末端と反応して不活性なグアニジノ副産物を形成できますが、ホスホニウム試薬はそうではありません。[20]
プロパンホスホン酸無水物
2000年代後半から、 「T3P」などのさまざまな名前で市販されているプロパンホスホン酸無水物は、商業用途でのアミド結合形成に有用な試薬となっています。これは、カルボン酸の酸素を脱離基に変換し、そのペプチド結合副産物は水溶性で簡単に洗い流すことができます。プロパンホスホン酸無水物と他のペプチド結合試薬との非ペプチド薬の調製における性能比較では、この試薬は収率と低いエピマー化に関して他の試薬よりも優れていることがわかりました。[21]
堅固なサポート
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ペプチド合成用の固体支持体は、液体の急速な濾過を可能にするために、物理的安定性を考慮して選択される。適切な支持体は、SPPS中に使用される試薬および溶媒に対して不活性であり、最初のアミノ酸の付着を可能にする。[22]ペプチド合成は固体支持体の膨潤した細孔内で行われるため、膨潤は極めて重要である。[23]
固体支持体には、ゲル型支持体、表面型支持体、複合材料の3つの主要な種類があります。[22]ペプチド合成に使用される固体支持体の改良により、SPPSの脱保護段階でのTFAの繰り返し使用に耐える能力が向上しました。[24][アップデート] C末端カルボン酸またはアミドのどちらが望ましいかに基づいて、2つの主要な樹脂が使用されます。1996年時点で、C末端カルボン酸を持つペプチドに最も一般的に使用されていた樹脂はWang樹脂でした。 [25] [更新が必要]
団体保護制度
前述のように、ペプチド合成においては、活性化アミノ酸の自己カップリングによる（重合）などの望ましくない副反応を避けるために、 N末端および側鎖保護基の使用が不可欠である。 [1]これは意図したペプチドカップリング反応と競合し、目的のペプチドの合成収率が低下したり、完全に失敗したりする可能性がある。[要出典]
固相ペプチド合成では、通常、2つの主要な保護基スキーム、いわゆるBoc/ベンジルおよびFmoc/ tert-ブチルアプローチが使用されています。[2] Boc/Bzl戦略は、TFAに不安定なN末端Boc保護と、最終切断ステップ（固体支持体からのペプチドの同時切断）中に無水フッ化水素を使用して除去される側鎖保護を使用します。Fmoc/tBu SPPSは、塩基に不安定なFmoc N末端保護を使用します。[26]
側鎖保護と酸不安定な樹脂結合を備えています (最終的な酸切断は TFA 処理によって行われます)。
両方のアプローチについて、それぞれの利点と欠点を含めて以下に詳しく説明します。
Boc/Bzl SPPS
SPPSが登場する前、化学ペプチド合成の溶液法では、一時的なN末端αアミノ保護基としてtert-ブチルオキシカルボニル（略して「Boc」）が使用されていました。Boc基は、トリフルオロ酢酸（TFA）などの酸で除去されます。これにより、過剰なTFAの存在下で正に帯電したアミノ基が形成され（右の図ではアミノ基がプロトン化されていないことに注意してください）、これが中和されて、入ってくる活性化アミノ酸と結合します。[27]中和は、結合前に発生することも、基本的な結合反応中に その場で発生することもあります。
Boc/Bzlアプローチは、合成中のペプチド凝集を減らす上でその有用性を維持している。[28]さらに、塩基に敏感な部分（デプシペプチドやチオエステル部分など）を含むペプチドを合成する場合、Fmoc脱保護ステップ中に塩基による処理が必要となるため（以下を参照）、Boc/ベンジルSPPSはFmoc/tert-ブチルアプローチよりも好ましい場合がある。
Boc/ベンジルSPPS中に使用される永久側鎖保護基は、通常、ベンジルまたはベンジルベースの基です。[1]固体支持体からのペプチドの最終的な除去は、加水分解による無水フッ化水素を使用した側鎖の脱保護と同時に行われます。最終生成物は、比較的溶解しやすいフッ化物塩です。反応性カチオンが望ましくない副産物を生成するのを防ぐために、 クレゾールなどのスカベンジャーをHFに加える必要があります。
FMOC/tBu SPPS
N末端Fmoc保護の使用により、Boc/Bzl SPPSに使用されるものよりも穏やかな脱保護スキームが可能になり、この保護スキームはSPPS条件下で真に直交しています。[30] Fmoc脱保護では、塩基、通常はDMF中の20～50％ピペリジンを使用します。[22]したがって、露出したアミンは中性であり、結果として、Boc/Bzlアプローチの場合のようにペプチド樹脂の中和は必要ありません。 ただし、ペプチド鎖間の静電反発がないため、Fmoc/ tBu SPPSでの凝集のリスクが高まります。 遊離したフルオレニル基は発色団であるため、Fmoc脱保護は反応混合物のUV吸光度によって監視することができ、これは自動ペプチド合成装置で採用されている戦略です。
Fmoc 基は比較的穏やかな塩基性条件下で切断され、酸に対して安定であるため、Boc/Bzl SPPS (HF) での最終切断に使用されるものよりも穏やかな酸性最終切断条件 (TFA) で除去できる Boc やt Bu などの側鎖保護基を使用できます。水やトリイソプロピルシラン(TIPS) などのスカベンジャーは、側鎖の脱保護の結果として放出される反応性カチオン種との副反応を防ぐために、最終切断中に最も一般的に追加されます。ただし、他の多くのスカベンジャー化合物も使用できます。[31] [32] [33]結果として得られる粗ペプチドは TFA 塩として得られ、これは Boc SPPS で生成されるフッ化物塩よりも溶解が難しい可能性があります。
Fmoc/ t Bu SPPS は、フルオレニル基が Boc 基よりはるかに大きいため、原子経済性が低くなります。したがって、Fmoc アミノ酸の価格は、最初の合成ペプチド薬の 1 つであるエンフビルタイドの大規模な試験が 1990 年代に開始されるまでは高かったものの、その後、市場の需要によって Fmoc アミノ酸と Boc アミノ酸の相対価格が調整されました。
その他の保護基
ベンジルオキシカルボニル
(Z)基はもう一つのカルバメート型アミン保護基であり、1930年代初頭にレオニダス・ゼルバスによって発見され、通常はベンジルクロロホルメートとの反応によって付加される。[34]
これは、酢酸中のHBr を使用する厳しい条件下で、またはより穏やかな条件の接触水素化によって除去されます。
この方法は、1932年にゼルバスとマックス・バーグマンによってオリゴペプチドの合成に初めて使用されました。[35]そのため、これはバーグマン-ゼルバス合成として知られるようになり、「画期的」と特徴付けられ、合成ペプチド化学を独自の分野として確立するのに役立ちました。[34]これは、制御されたペプチド合成のための最初の有用な実験室方法となり、反応性側鎖を持つ以前は達成できなかったペプチドの合成を可能にし、Z保護アミノ酸のラセミ化も防止しました。[34] [35]
ベルクマン-ゼルバス法は、発表後20年間にわたってペプチド化学の標準的な方法であり続けましたが、1950年代初頭に新しい方法（Boc保護基など）に取って代わられました。[34]現在では、α-アミン保護に定期的に使用されていますが、側鎖保護によく使用されています。
割り当ておよびその他のグループ
アリルオキシカルボニル（alloc）保護基は、直交脱保護スキームが必要な場合にアミノ基（またはカルボン酸またはアルコール基）を保護するために使用されることがあります。また、ペプチドが側鎖官能基によって樹脂に結合している樹脂上での環状ペプチド形成を行うときにも使用されることがあります。Alloc基はテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）を使用して除去できます。[36]
タンパク質マイクロアレイを含む合成工程のような特殊な用途では、「リソグラフィック」と呼ばれる保護基が使用され、これは特定の波長の光で光化学反応を起こしやすく、リソグラフィックタイプの操作中に除去することができます。[37] [38] [39] [40]
位置選択的ジスルフィド結合形成
複数のネイティブジスルフィドの形成は、固相法によるネイティブペプチド合成の課題として残っています。ランダムな鎖の組み合わせにより、通常、非ネイティブジスルフィド結合を持ついくつかの生成物が生成されます。[41]段階的なジスルフィド結合の形成は通常、チオール保護基を使用して行われる好ましい方法です。[42]異なるチオール保護基は、複数の次元の直交保護を提供します。これらの直交保護されたシステインは、ペプチドの固相合成中に組み込まれます。これらの基を連続的に除去して遊離チオール基を選択的に露出させることにより、段階的にジスルフィドが形成されます。基の除去順序は、一度に1つの基のみが除去されるように考慮する必要があります。
ペプチド合成において、後に位置選択的なジスルフィド結合形成を必要とするチオール保護基は、複数の特性を備えている必要がある。[43] [44]まず、保護されていない側鎖に影響を与えない条件で可逆的でなければならない。次に、保護基は固相合成の条件に耐えることができなければならない。第三に、直交保護が望まれる場合、チオール保護基の除去は、他のチオール保護基をそのまま残すように行われなければならない。つまり、PG A の除去は PG B に影響を与えてはならない。一般的に使用されるチオール保護基には、アセトアミドメチル (Acm)、tert -ブチル (But)、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル (NPYS)、2-ピリジンスルフェニル (Pyr)、およびトリチル(Trt) 基が含まれる。[43]重要なのは、NPYS 基が Acm PG を置き換えて活性化チオールを生成できることである。[45]
この方法を用いて、木曽らは1993年にインスリンの最初の全合成を報告した。[46]この研究では、インスリンのA鎖は、そのシステインに次の保護基を配置して調製された：CysA6（But）、CysA7（Acm）、およびCysA11（But）、CysA20は保護されていない。[46]
マイクロ波支援ペプチド合成
マイクロ波を利用したペプチド合成は、高収率かつ低ラセミ化で長いペプチド配列を完成させるために使用されている。[47] [48]
連続フロー固相ペプチド合成
連続フローペプチド合成に関する最初の論文は1986年に発表されましたが[49] 、技術的な制限により、より多くの学術グループがペプチドの急速合成に連続フローを使用し始めたのは2010年代初頭になってからでした。[50] [51]従来のバッチ法に対する連続フローの利点は、試薬を適切な温度制御で加熱できるため、副反応を最小限に抑えながら反応速度を上げることができることです。[52]サイクル時間は、反応条件と試薬の過剰量に応じて、30秒から最大6分まで異なります。
UV/Vis分光法や樹脂量をモニタリングする可変床フローリアクター（VBFR）などのインライン分析により、樹脂上の凝集を識別し、カップリング効率を評価することができます。[53]
長いペプチドの合成
段階的伸長法は、アミノ酸を段階的に連結するもので、2～100個のアミノ酸残基を含む小さなペプチドに最適です。もう1つの方法は、ペプチド断片を結合させるフラグメント凝縮です。 [54] [55] [56]前者はラセミ化せずにペプチド鎖を伸長できますが、長いペプチドや極性の高いペプチドの作成にのみ使用すると収率が低下します。フラグメント凝縮は、高度な長いペプチドを合成するには段階的伸長法よりも優れていますが、ラセミ化を防ぐためにその使用を制限する必要があります。フラグメント凝縮は、結合したフラグメントが過剰である必要があり、フラグメントの長さによっては制限となる可能性があるため、望ましくありません。[57]
より長いペプチド鎖を製造するための新しい開発は化学連結である。保護されていないペプチド鎖は水溶液中で化学選択的に反応する。最初の速度論的に制御された生成物は転位してアミド結合を形成する。ネイティブ化学連結の最も一般的な形態は、末端システイン残基と反応するペプチドチオエステルを使用する。[58]
水溶液中でポリペプチドを共有結合させる他の方法としては、スプリットインテインの使用[59]、自発的なイソペプチド結合の形成[60]、ソルターゼライゲーション[61]などがある。
長いペプチドの合成を最適化するために、メディコンバレーでペプチド配列を変換する方法が開発された。[要出典]ペプチドのC末端に組み込まれた 単純なプレシーケンス（例：リジン（Lysn）、グルタミン酸（Glun）、（LysGlu）n）は、 αヘリックスのような構造を誘導する。これにより、生物学的半減期が延長し、ペプチドの安定性が向上し、薬理学的活性や作用プロファイルを変更することなく酵素分解が阻害される可能性がある。[62] [63]
環状ペプチド
樹脂の環化について
ペプチドは固体支持体上で環化することができる。HBTU/HOBt/DIEA、PyBop/DIEA、PyClock/DIEAなど、さまざまな環化試薬を使用することができる。[64]固体支持体上でヘッドツーテールペプチドを作製することができる。適切な時点でC末端を脱保護すると、脱保護されたN末端とのアミド結合形成による樹脂上環化が可能になる。環化が起こると、ペプチドは酸分解によって樹脂から切り離され、精製される。[65] [66]
環状ペプチドの固相合成戦略は、Asp、Glu、Lys 側鎖を介した結合に限定されない。システインは、側鎖に非常に反応性の高いスルフィドリル基を持っている。1 つのシステインの硫黄原子が、タンパク質の別の部分にある 2 番目のシステインの別の硫黄原子と単一の共有結合を形成すると、ジスルフィド結合が形成される。これらの結合は、特に細胞から分泌されるタンパク質を安定化させるのに役立つ。一部の研究者は、S-アセトアミドメチル (Acm) を使用して修飾システインを使用し、ジスルフィド結合の形成をブロックしながら、システインとタンパク質の元の一次構造を保存している。[67]
樹脂外環化
樹脂外環化は、重要な中間体の固相合成であり、その後に溶液相で重要な環化が行われ、マスクされた側鎖の最終的な脱保護も溶液相で行われます。これには、固相合成の効率が溶液相段階で失われること、副産物、試薬、未変換物質からの精製が必要であること、およびマクロサイクル形成が関与する場合は望ましくないオリゴマーが形成される可能性があるという欠点があります。[68]
ペンタフルオロフェニルエステル（FDPP、 [69] PFPOH [70]）およびBOP-Cl [71]の使用はペプチドの環化に有用である。
歴史
最初の保護ペプチドは1882年にテオドール・クルティウスによって合成され、最初の遊離ペプチドは1901年にエミール・フィッシャーによって合成されました。[3]
参照
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外部リンク
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