電気生理学

電気生理学（ギリシャ語の ἥλεκτ、ēlektron、「琥珀色」[ 「電子」の語源を参照]、φύσις、physis、「性質、起源」、-λογία、-logiaに由来）は、生物細胞および組織の電気的特性を研究する生理学の分野です。単一のイオンチャネルタンパク質から心臓などの臓器全体まで、さまざまなスケールでの電圧変化または電流の測定または操作が含まれます。神経科学では、ニューロンの電気的活動、特に活動電位活動の測定が含まれます。脳波記録などの神経系からの大規模な電気信号の記録は、電気生理学的記録と呼ばれることもあります。^{[1]これらは}電気診断およびモニタリングに役立ちます。

電気生理学^{[2]は、生物組織におけるイオンの流れ（}イオン電流）に広く関係する生理学の分野であり、特にこの流れを測定できる電気記録技術に関係する。古典的な電気生理学技術では、さまざまな生物組織の標本に電極を配置する。主な電極の種類は以下のとおりである。

1. ディスクや針などの単純な固体導体（単一または配列、多くの場合、先端を除いて絶縁されている）、
2. プリント基板またはフレキシブルポリマー上のトレース（先端部以外は絶縁されている）
3. 塩化カリウム溶液または他の電解質溶液が満たされたガラスピペットなど、電解質が満たされた中空の、多くの場合は細長いまたは「引っ張られた」チューブ。

主な準備は次のとおりです。

1. 生物（昆虫の例）
2. 切除された組織（急性または培養）
3. 切除組織から分離した細胞（急性または培養）
4. 人工的に培養された細胞や組織、または
5. 上記のハイブリッド。

神経電気生理学は、神経系内の生物学的細胞および組織の電気的特性を研究する学問です。神経電気生理学では、医師や専門家は個人の脳の活動を調べることで、神経障害がどのように起こるかを判断できます。活動とは、遭遇した状況で脳のどの部分が光るかなどです。電極の直径が十分に小さい場合 (マイクロメートル)、電気生理学者は先端を単一の細胞に挿入することを選択できます。このような構成により、単一細胞の細胞内電気活動を直接観察し、細胞内記録することができます。ただし、この侵襲的な設定により、細胞の寿命が短くなり、細胞膜を介した物質の漏出が発生します。

細胞内活動は、電解質を含む特別に形成された（中空の）ガラスピペットを使用して観察することもできます。この技術では、微細なピペットの先端を細胞膜に押し付け、ガラスと細胞膜の脂質との相互作用によってピペットの先端が細胞膜にしっかりと接着します。ピペットに負圧のパルスを与えてピペットの縁で囲まれた小さな膜パッチを破裂させることで、ピペット内の電解質を細胞質と流体連続させることができます（全細胞記録）。または、電解質内の外因性孔形成剤が膜パッチに挿入できるようにパッチを「穿孔」することでイオン連続性を確立することもできます（穿孔パッチ記録）。最後に、パッチをそのままにしておくこともできます（パッチ記録）。

電気生理学者は、先端を単一の細胞に挿入しないことを選択する場合があります。代わりに、電極の先端を細胞外空間と連続した状態のままにしておくことができます。先端が十分に小さい場合、このような構成により、単一細胞からの活動電位を間接的に観察および記録できます。これを単一ユニット記録と呼びます。準備と正確な配置によっては、細胞外構成で複数の近くの細胞の活動を同時に検出できます。これをマルチユニット記録と呼びます 。

電極のサイズが大きくなると、分解能は低下します。より大きな電極は、局所電場電位と呼ばれる多数の細胞の純活動にのみ反応します。臨床および外科神経生理学者が使用する非絶縁針や表面電極などのさらに大きな電極は、数百万に及ぶ細胞集団内の特定の種類の同期活動にのみ反応します。

その他の古典的な電気生理学的手法には、単一チャネル記録と電流測定法が含まれます。

電気生理学的記録は一般にエレクトログラフィー（electro- + -graphy、「電気的記録」から）と呼ばれることもあり、このようにして作成された記録は電気図になります。ただし、エレクトログラフィーという単語には他の意味（電気写真法など）があり、特定の種類の電気生理学的記録は通常、 electro- + [身体部分の結合形] + -graphy （略語ExG）のパターンに基づいて構成された特定の名前で呼ばれます。関連して、エレクトログラムという単語（他の意味には必要ない）は、多くの場合、心内電気図という特定の意味を持ちます。これは心電図に似ていますが、非侵襲的リード（皮膚上）だけでなく、侵襲的リード（心臓内）がいくつかあります。臨床診断目的の電気生理学的記録は、電気診断検査のカテゴリに含まれます。さまざまな「ExG」モードは次のとおりです。

光電気生理学的手法は、従来の手法の主な限界の 1 つを克服するために科学者やエンジニアによって考案されました。従来の手法では、組織内のほぼ 1 点における電気活動を観察できます。従来の手法では、分散した現象を単一化します。生体電気活動の空間分布への関心から、電気的または化学的環境に応じて光を発する分子の開発が促進されました。例としては、電圧感受性染料や蛍光タンパク質があります。灌流、注射、または遺伝子発現によって 1 つ以上のこのような化合物を組織に導入すると、電気活動の 1 次元または 2 次元分布を観察および記録できます。^[要出典]

細胞内記録では、細胞膜を横切る電圧や電流を測定します。細胞内記録を行うには、細い（鋭い）微小電極の先端を細胞内に挿入して膜電位を測定する必要があります。通常、健康な細胞の静止膜電位は -60 ～ -80 mV ですが、活動電位時には膜電位は +40 mV に達することがあります。1963 年、アラン ロイド ホジキンとアンドリュー フィールディング ハクスリーは、ニューロンにおける活動電位の発生メカニズムの解明に貢献したことでノーベル生理学・医学賞を受賞しました。彼らの実験は、大西洋イカ（Loligo pealei ）の巨大軸索からの細胞内記録に関するもので、「電圧クランプ」技術の最初の応用例の 1 つでした。^[4]

現在、細胞内記録に使用されるほとんどの微小電極は、先端の直径が 1 マイクロメートル未満で、抵抗が数メガオームのガラス製マイクロピペットです。マイクロピペットには、細胞の細胞内液とイオン組成が類似した溶液が充填されています。ピペットに挿入された塩化銀線は、電解質を増幅器および信号処理回路に電気的に接続します。電極によって測定された電圧は、参照電極の電圧と比較されます。参照電極は通常、細胞の周りの細胞外液と接触している塩化銀でコーティングされた銀線です。一般に、電極の先端が小さいほど、電気抵抗は高くなります。そのため、電極はサイズ (細胞へのダメージを最小限に抑えながら単一の細胞を貫通できるほど小さい) と抵抗 (電極の先端の熱雑音から小さな神経信号を識別できるほど低い) の間の妥協点になります。

健康な脳スライスを維持することは、電気生理学的記録を成功させる上で極めて重要です。これらのスライスの準備は、一般的にコンプレストーム・ビブラトームなどのツールで行われ、正確で信頼性の高い記録のための最適な条件が確保されます。^[5]しかし、最高水準の組織処理を行ったとしても、スライスの準備は脳の主要な免疫細胞であるミクログリアの急速かつ強力な表現型変化を引き起こすため、このモデルを使用する際にはこれを考慮する必要があります。^[6]

電圧クランプ法では、実験者は細胞電位を選択した値に「クランプ」することができます。これにより、任意の電圧で細胞膜を通過するイオン電流の量を測定することができます。これは、ニューロンの膜にあるイオンチャネルの多くが電圧依存性イオンチャネルであり、膜電圧が特定の範囲内にある場合にのみ開くため重要です。電流の電圧クランプ測定は、記録電極と細胞膜が充電されて細胞の電位が変化するときに通過する過渡容量性電流をほぼ同時にデジタル減算することで可能になります。^{[引用が必要]}

電流クランプ法は、記録電極を通して細胞に電流を注入することで膜電位を記録します。膜電位が実験者によって決定されたレベルに保持される電圧クランプ モードとは異なり、「電流クランプ」モードでは膜電位は自由に変化し、アンプは細胞が自らまたは刺激の結果として生成する電圧を記録します。この技術は、電流が細胞に入ったときに細胞がどのように反応するかを調べるために使用されます。これは、たとえば、膜イオン チャネルを開くことによって作用する神経伝達物質にニューロンがどのように反応するかを理解するために重要です。^{[引用が必要]}

ほとんどの電流クランプ増幅器は、細胞から記録された電圧変化をほとんどまたはまったく増幅しません。「増幅器」は実際には電位計であり、「ユニティ ゲイン増幅器」と呼ばれることもあります。その主な目的は、細胞によって生成される小さな信号 (mV 範囲) の電気的負荷を軽減して、低インピーダンスの電子機器で正確に記録できるようにすることです。増幅器は、信号に流れる電流を増加させると同時に、その電流が通過する抵抗を減らします。オームの法則に基づく次の例を考えてみましょう。10 mV の電圧は、10ナノアンペアの電流を 1 MΩの抵抗に流すことで生成されます。電位計は、電圧フォロワ回路を使用して、この「高インピーダンス信号」を「低インピーダンス信号」に変換します。電圧フォロワは、入力の電圧 (大きな抵抗器を流れる小さな電流によって発生) を読み取ります。次に、背後に大きな電流源 (電源) がある並列回路に指示し、その並列回路の抵抗を調整して、同じ出力電圧を、より低い抵抗で出力します。

この技術は、1991 年にノーベル賞を受賞したエルヴィン・ネーアーとバート・ザックマンによって開発されました。 ^[7]従来の細胞内記録では、細い電極を細胞に刺す必要がありますが、パッチ クランプ記録では別のアプローチが採用されています。パッチ クランプ マイクロ電極は、先端の直径が比較的大きいマイクロピペットです。マイクロ電極を細胞の横に配置し、マイクロ電極を通して穏やかな吸引力をかけることで、細胞膜の一部 (「パッチ」) をマイクロ電極の先端に引き込みます。ガラスの先端は、細胞膜と高抵抗の「シール」を形成します。この構成は「細胞付着」モードであり、膜のパッチに存在するイオン チャネルの活動を研究するために使用できます。ここでさらに吸引力をかけると、電極の先端にある小さな膜のパッチが移動し、電極が細胞の残りの部分に密着したままになります。この「細胞全体」モードでは、非常に安定した細胞内記録が可能です。欠点は（鋭い電極を使った従来の細胞内記録と比較すると）、細胞の細胞内液が記録電極内の溶液と混ざり、細胞内液の重要な成分が希釈される可能性があることです。この技術のバリエーションである「穿孔パッチ」技術は、これらの問題を最小限に抑えようとしています。吸引力を加えて膜パッチを電極の先端から移動させる代わりに、孔形成剤を使用してパッチに小さな穴を開けることもできます。これにより、タンパク質などの大きな分子が細胞内に留まり、イオンが穴を自由に通過できるようになります。また、膜パッチを細胞の残りの部分から引き離すこともできます。このアプローチにより、パッチの膜特性を薬理学的に分析できます。パッチクランプは、記録後に細胞の内容物を抽出して、遺伝子発現および細胞タイプに対する電気生理学的特性の関係を特徴付けることにより 、パッチシーケンスと呼ばれる技術でRNAシーケンシングと組み合わせることもできます。

細胞内液のイオン構成への影響​​を最小限に抑えながら細胞膜内の電位を記録したい場合は、鋭利な電極を使用することができます。これらのマイクロピペット（電極）は、ガラス毛細管から引き出されたパッチクランプ用のものと似ていますが、細孔がはるかに小さいため、細胞内液とピペット内の電解質との間のイオン交換はほとんどありません。マイクロピペット電極の電気抵抗は、パッチクランプで使用される細胞内イオン濃度を模倣した塩濃度ではなく、2〜4M KClで満たすことで低下します。^[8]多くの場合、電極の先端には、後で顕微鏡で形態を確認するために、記録した細胞を満たすために、ルシファーイエローなどのさまざまな種類の染料が満たされています。染料は、染料の極性に応じて、電極に正または負のDCまたはパルス電圧を印加することによって注入されます。

生きた動物の脳に挿入された電極は、電極の先端に隣接するニューロンによって生成される電気活動を検出します。電極が先端サイズが約 1 マイクロメートルのマイクロ電極である場合、電極は通常、最大で 1 つのニューロンの活動を検出します。この方法で記録することは、一般に「単一ユニット」記録と呼ばれます。記録される活動電位は、細胞内で記録される活動電位と非常に似ていますが、信号は非常に小さくなります (通常、約 1 mV)。麻酔をかけられた意識のある動物の単一ニューロンの活動の記録のほとんどは、この方法で行われます。生きた動物の単一ニューロンの記録は、脳がどのように情報を処理するかについて重要な洞察を提供してきました。たとえば、David HubelとTorsten Wiesel は、麻酔をかけた猫の一次視覚皮質の単一ニューロンの活動を記録し、この領域の単一ニューロンが視覚刺激の非常に特定の特徴にどのように反応するかを示しました。^[9]ヒューベルとヴィーゼルは1981年にノーベル生理学・医学賞を受賞した。^[10]

このような電極挿入のために脳を準備するために、コンプレストーム・ビブラトーム、ライカ・ビブラトーム、ミクロトームなどの繊細なスライス装置がよく使用されます。これらの器具は、電極配置に必要な正確で薄い脳切片を得るのに役立ち、神経科学者が記録のために特定の脳領域をターゲットにすることを可能にします。^[11]

電極の先端が少し大きい場合、電極は複数のニューロンによって生成された活動を記録できます。このタイプの記録は「マルチユニット記録」と呼ばれることが多く、意識のある動物で、通常の活動中に個別の脳領域の活動の変化を記録するためによく使用されます。1 つ以上のこのような電極を近接して配置して記録すると、その周囲の細胞の数や、どのスパイクがどの細胞から発生したかを特定できます。このプロセスはスパイク ソーティングと呼ばれ、スパイク特性が明確に定義された細胞の種類が特定されている領域に適しています。電極の先端がさらに大きい場合、一般に個々のニューロンの活動を区別することはできませんが、電極は多数の細胞の活動によって生成されたフィールド電位を記録できます。

細胞外電場電位は、多数の細胞の集団活動によって生成される局所的な電流シンクまたはソースです。通常、電場電位は、シナプス伝達による多数のニューロンの同時活性化によって生成されます。右の図は、海馬のシナプス電場電位を示しています。右側では、下のトレースは、シナプス後グルタミン酸受容体を介して細胞に入る正電荷によって引き起こされる電流シンクに対応する負の波を示しており、上のトレースは、回路を完了するために細胞（細胞体）から出る電流によって生成される正の波を示しています。詳細については、局所電場電位を参照してください。

アンペロメトリーでは、炭素電極を使用して、生体溶液の酸化成分の化学組成の変化を記録します。酸化と還元は、「スキャン」と呼ばれるプロセスで記録電極の活性表面の電圧を変更することによって行われます。特定の脳化学物質は特徴的な電圧で電子を失ったり獲得したりするため、個々の種を識別できます。アンペロメトリーは、神経系および内分泌系におけるエキソサイトーシスの研究に使用されています。多くのモノアミン神経伝達物質、たとえばノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、ドーパミン、セロトニン(5-HT) は酸化可能です。この方法は、5-HT またはドーパミンを「ロード」することで、酸化可能な神経伝達物質を分泌しない細胞にも使用できます。

平面パッチクランプは、ハイスループット電気生理学のために開発された新しい方法です。^[12]接着細胞の上にピペットを配置する代わりに、細胞懸濁液を微細構造の開口部を含むチップ上にピペットで移します。次に、吸引によって単一の細胞を穴に配置し、しっかりとした接続（ギガシール）を形成します。平面形状は、従来の実験と比較してさまざまな利点があります。

• マイクロ流体の統合が可能になり、イオンチャネルスクリーニングのための自動化合物適用が可能になります。
• このシステムは、光学式または走査プローブ技術で利用できます。
• 細胞内側の灌流が行えます。

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  従来のパッチクランプ構成の概略図。パッチピペットは、光学制御されたマイクロマニピュレータを使用して細胞まで移動します。細胞とピペットの接続を損なわないようにするには、ピペットと細胞間の相対的な動きを避ける必要があります。
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  パッチピペットの走査型電子顕微鏡画像。
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  平面パッチ構成では、セルは吸引によって配置されます。密閉後は、セルと開口部の相対的な動きを排除できます。防振テーブルは必要ありません。
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  平面パッチクランプ チップの走査型電子顕微鏡画像。ピペットとチップは両方ともホウケイ酸ガラスで作られています。

この電気生理学的アプローチでは、対象のチャネルまたはトランスポーターを含むプロテオリポソーム、膜小胞、または膜断片を、機能化電極上に塗布された脂質単分子層に吸着させる。この電極は、ガラス支持体、クロム層、金層、およびオクタデシルメルカプタン単分子層からなる。塗布された膜は電極によって支持されるため、固体支持膜と呼ばれる。通常、生体脂質膜を破壊する機械的摂動は、SSM の寿命に影響を与えない。静電容量電極 (SSM と吸収された小胞で構成) は機械的に非常に安定しているため、その表面で溶液を急速に交換することができる。この特性により、基質/リガンド濃度の急激な変化を適用して、小胞と電極間の静電結合を介して測定される対象のタンパク質の起電活性を調べることができる。^[13]

生体電気認識アッセイ (BERA) は、ゲル マトリックスに固定された細胞の膜電位の変化を測定することで、さまざまな化学分子や生物分子を判定する新しい方法です。電極と細胞の界面の安定性が向上するだけでなく、固定化によって細胞の生存能力と生理機能が維持されます。BERA は主にバイオセンサー アプリケーションで使用され、細胞膜電位を変化させることで固定化細胞と相互作用する分析対象物を分析します。このように、陽性サンプルをセンサーに追加すると、特徴的な「シグネチャのような」電位の変化が発生します。BERA は、最近開始されたヨーロッパ全域の FOODSCAN プロジェクト (ヨーロッパにおける農薬と食品のリスク評価に関するプロジェクト) のコア テクノロジーです。^[14] BERAは、ヒトウイルス（B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス）^[15] 、獣医病原体（口蹄疫ウイルス、プリオン、ブルータングウイルス）、植物ウイルス（タバコウイルス、キュウリウイルス）^[16]の検出に、特異的、迅速（1～2分）、再現性、コスト効率に優れた方法で使用されています。この方法は、食品中の農薬^{[17] [18] [19]}やマイコトキシン^[20]、コルクやワイン中の2,4,6-トリクロロアニソール^{[21] [22]などの環境毒素の検出や、臨床サンプル中の極低濃度の}スーパーオキシドアニオンの測定にも使用されています。^{[23] [24]}

BERA センサーには 2 つの部分があります。

• 消耗性生体認識素子
• 人工知能を組み込んだ電子読み出し装置。^[25]

最近の進歩は、膜工学による分子同定（MIME）と呼ばれる技術の開発です。この技術は、何千もの人工受容体を細胞膜に埋め込むことで、事実上あらゆる分子に対して定義された特異性を持つ細胞を構築することを可能にします。^[26]

厳密には実験測定ではないが、タンパク質や生体膜の導電性をコンピューターで調べる方法が開発されている。これらは主に分子動力学シミュレーションであり、脂質二重層のようなモデル系に外部から電圧をかける。これらのセットアップを使用した研究では、膜の電気穿孔^{[27]やチャネルによるイオンの移動[28]}などの動的現象を研究することができた。

このような方法の利点は、原子シミュレーションが本質的に高い解像度とデータ密度を提供することで、活性伝導メカニズムの詳細度が高くなることです。モデルの正当性の不確実性と、システム自体のマクロ的な特性を再現するのに十分な大きさと時間スケールを持つシステムをモデル化するための計算コストによって、大きな欠点があります。原子シミュレーションはマイクロ秒領域に近い、またはマイクロ秒領域に入る時間スケールにアクセスできますが、それでもパッチクランプなどの実験方法の解像度よりも数桁低いです。^[要出典]

臨床電気生理学は、電気生理学の原理と技術を人間の健康にどのように応用できるかを研究する学問です。たとえば、臨床心臓電気生理学は、心臓のリズムと活動を支配する電気的特性を研究する学問です。心臓電気生理学は、不整脈(不整脈)などの疾患を観察し、治療するために使用できます。たとえば、医師は心臓に電極の付いたカテーテルを挿入して、心筋の電気的活動を記録することがあります。

臨床電気生理学のもう一つの例は、臨床神経生理学です。この医学の専門分野では、医師は脳、脊髄、神経の電気的特性を測定します。デュシェンヌ・ド・ブローニュ（1806年 - 1875年）やナサニエル・A・ブッフバルト（1924年 - 2006年）などの科学者は、神経生理学の分野を大きく進歩させ、臨床応用を可能にしたと考えられています。

最小情報（MI）標準または報告ガイドラインは、臨床研究の特定の目的を達成するために必要なメタデータ（情報）とデータの最小量を指定します。「神経科学研究に関する最小情報」（MINI）報告ガイドライン文書ファミリーは、電気生理学実験を報告するための一貫したガイドラインセットを提供することを目的としています。実際には、MINIモジュールは、データセットが出版用に説明されるときに提供する必要がある情報（たとえば、使用されたプロトコルについて）のチェックリストで構成されています。^[29]

• 平面パッチクランプに関する本の章 2010年3月31日アーカイブウェイバックマシン