パッチシーケンス

細胞の種類を定義する際にはニューロンの電気的特性が重要ですが、その形態、放出される神経伝達物質の種類、シナプスで発現する神経伝達物質受容体、神経系におけるニューロンの位置、および局所回路も同様に重要です。ニューロンは、細胞体（ソマ）、樹状突起、軸索に多くの違いがあり、形状が非常に多様です。樹状突起の位置によって、細胞がどの他のニューロンから入力を受け取るかが決まり、樹状突起の形状は、ニューロンがこの入力にどのように反応するかに大きな影響を与える可能性があります。同様に、ニューロンの軸索の標的によって、その出力が決まります。ニューロンの軸索と樹状突起の間に形成されるシナプスの種類も同様に重要です。^{[ 1 ]} 例えば、右図に示す哺乳類の皮質の皮質マイクロ回路では、細胞は局所回路内だけでなく、皮質領域と非皮質領域をまたいで、非常に特異的な投射パターンを持っています。樹状突起の形状はニューロンの電気的挙動にも影響を与え、樹状突起がシナプス後電位の形で入力を処理する方法に大きな影響を与えます。形状と投射パターンの乱れは、自閉症や統合失調症を含むさまざまな精神疾患や神経疾患と関連付けられていますが、これらの表現型の行動的関連性はまだ理解されていません。^{[ 2 ]}ニューロン細胞の種類は、互いに連続的に変化することが多いようです。形態電気的特性によるニューロンの分類のこれまでの試みは、互換性のない方法論の使用と異なる細胞株の選択によって制限されてきました。^{[ 3 ]}

シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）の登場により、特定の古典的に定義された特性を持つニューロンでのみ一貫して発現する遺伝子が存在することが期待されました。これらの遺伝子は細胞マーカーとして機能します。これにより、mRNAシーケンスのみを使用して、ニューロンの種類を迅速かつ容易に区別するためのより良い手段が提供されます。しかし、scRNA-seqは、過度に厳格な細胞タイプの定義がニューロンを特徴付ける最良の方法ではないという事実を強化するだけであるように思われました。^{[ 4 ]} さらに、遺伝子発現は動的に制御され、ニューロンの可塑性を可能にするために、細胞タイプ特有の方法で活動に応じてさまざまな時間スケールで変化します。^{[ 5 ] [ 6 ]} 他の組織と同様に、発生プロセスも考慮する必要があります。^{[ 7 ]} これらのすべての理由から、scRNA-seqの結果を古典的に定義されたニューロン細胞タイプに一致させることは非常に困難です^{[ 8 ]。}さらに、シングルセルRNA-seqには、ニューロンの分類に関する独自の欠点があります。 scRNA-seqは個々のニューロンの遺伝子発現パターンの研究を可能にするが、個々の細胞を分離するために組織を破壊するため、組織内でのニューロンの元の位置を推測したり、その形態を観察したりすることは困難である。電気生理学的および形態学的特徴によって以前に定義されたニューロンのサブタイプにシーケンス情報をリンクすることは、時間がかかり複雑なプロセスである。^{[ 9 ]} patch-seqによる複数のデータタイプの同時取得と統合は、ニューロンの分類に最適であり、遺伝子発現、電気生理学的および形態学的特性とニューロン機能の間の新しい相関関係を明らかにする。^{[ 10 ]}このため、patch-seqは真に学際的な方法であり、電気生理学、シーケンス、およびイメージングの専門家間の協力が必要となる。^{[ 10 ]}

パッチピペットは全細胞記録用に設計されているため、その開口径は単一イオンチャネルを調べる実験よりも大きい。ほとんどの場合、標準的なパッチクランププロトコルを使用できるが、ピペットと内部溶液には状況に応じて若干の変更を加える必要がある。細胞内部をピペット内に吸引しやすくするために、さらに広い直径を使用することもできるが、対象細胞の種類に基づいて調整する必要があるかもしれない。^{[ 23 ]}負圧をかけることでシールを強化し、記録に有利になるだけでなく、細胞内容物の収集後または収集中に細胞内液の漏出や汚染を防ぐことができる。記録中は、ビオチンをピペットを介して細胞内に拡散させ、イメージングやその後の形態学的再構築に利用できる。^{[ 18 ]}

シールが確立されると、細胞は電圧クランプを使用して、ランプ、方形パルス、ノイズ電流注入などのさまざまな刺激レジメンに曝されます。静止膜電位や閾値電位などの細胞体膜の特徴が記録されます。生成された活動電位 (AP)から観察されるAP 幅、AP 振幅、後脱分極、後過分極振幅などの特徴も記録されます。^{[ 3 ] [ 9 ]} 全細胞記録は、少量の細胞内溶液 (RNA の希釈を避けるため)、カルシウムキレート剤、RNA キャリア、RNase 阻害剤で満たされたパッチ記録ピペットを使用して実行されます。^{[ 10 ]} EGTA などの RNase 阻害剤の添加は、サンプルからより高品質の RNA を保持することにより、トランスクリプトーム解析を強化します。^{[ 9 ]}記録時間は、膨潤によるニューロン構造への影響なしに 1 ～ 15 分かかる場合があり、値が小さいほど、この技術のスループットが向上します。^{[ 14 ]データは、MIES [ 3 ] [ 24 ]} PATCHMASTER ^{[ 25 ]} pCLAMP ^{[ 26 ]} WaveSurfer ^{[ 27 ]}などの商用またはオープンソースのソフトウェアを使用して記録および分析されます。

ニューロンは、静止膜電位を確認し、実験全体および実験内でベースラインを安定させるために、事前に刺激されます。次に、細胞はランプ電流と方形電流によって刺激され、その電気生理学的特性が記録および測定されます。刺激後、記録が一貫性があり堅牢であるためには、膜電位がベースライン値に戻る必要があります。記録の最後に負圧を使用して膜の安定性を回復します。測定値は、さらなる分析の対象となるために、これらの条件を満たす必要があります。^{[ 14 ]} パッチクランプは細胞にとってストレスとなるため、記録中は細胞の生存率を維持する必要があります。

電気生理学的記録には、健康な急性または生きた脳スライスが不可欠です。ニューロンの健康状態は、得られるデータの質に大きく影響するからです。健康な脳スライスは通常、コンプレッストーム振動切片などのツールを使用して準備され、正確で信頼性の高い記録のための最適な条件が確保されます。^{[ 28 ]}

負圧は、電極を細胞体の中心付近に移動させながら、核をピペットの先端付近に移動させるために使用されます。対象となるモデルシステムによって、適用する負圧が変わります。ヒトおよび非ヒト霊長類では、細胞の生存を確保することがより困難です。げっ歯類モデルと比較してニューロンのサイズのばらつきが大きいということは、細胞質と核を抽出するために適用する必要のある負圧の量に大きなばらつきがあることを意味します。^{[ 10 ]}回収後、ピペットは負圧を維持しながらゆっくりと引き抜かれ、先端が膜シールを形成して核を囲む膜が細胞から剥がれます。膜シールは、ピペット内に抽出された内容物を閉じ込め、ピペットを別の記録用に準備する前に、シーケンスのために取り出す際の汚染を防ぎます。シールの形成は、抵抗（MΩ）の増加によって電気的に観察できます。^{[ 14 ]}回収プロセスは、細胞を破裂させないように精密さが必要なため、通常10分程度かかります。^{[ 14 ]}

RNA-seq解析は、記録されたニューロンから抽出された核と細胞質を用いて行われる。^{[ 9 ] [ 14 ]} RNAは全長cDNAに増幅され、シーケンス用のライブラリーが構築される。核を含む解析では、mRNAの収量が高くなるだけでなく、データ品質も向上する。^{[ 3 ]}

サンプルはRNA含有量に高いばらつきがあり、場合によってはアストロサイトや他の種類のニューロンなどの隣接細胞からのRNA汚染が含まれる。品質は定義されたマーカー遺伝子によって評価され、RNA含有量に目的の細胞クラスのターゲットが含まれているかどうか（オンマーカー）、および汚染マーカーがないかどうか（オフマーカー）が示される。^{[ 14 ]} 収集されたRNAの品質を判断するためにさまざまな指標が使用される。

• 正規化マーカー合計（NMS）スコア：パッチシーケンス細胞からのオンマーカー遺伝子の比率を、蛍光活性化セルソーティング（FACS）などの細胞解離法を用いた類似データからの同じ遺伝子の中央値発現と比較したものです。細胞解離法は技術的な問題を軽減し、標準化法として機能します。^{[ 19 ]}このスコアは、サンプルから既知の細胞クラスへの遺伝子発現の類似性パターンを測定します。NMSスコアが低いほど、オフマーカー遺伝子の増加よりもオンマーカー遺伝子の検出の減少を示します。^{[ 14 ]}
• 汚染スコア：抽出中に近くの細胞からRNAが汚染される可能性を示します。汚染は、ピペットが細胞体まで移動し、他の神経突起と相互作用することによって発生する可能性があります。^{[ 19 ]}これは、割り当てられた細胞クラスと一致しないすべての広範な細胞タイプのNMSスコアの合計として計算されます。
• 品質スコア：パッチシーケンスの結果から得られたオンマーカー遺伝子とオフマーカー遺伝子の相関を、同じタイプの細胞解離法を用いて解析した細胞の平均発現プロファイルと比較します。 ^{[ 14 ]}
• 核存在マーカー：核特異的遺伝子（哺乳類のMalat1など） ^{[ 19 ] [ 29 ]}の検出とイントロンリードの比率の増加は、RNA-seq解析における核の組み込みの証拠となる。

樹状突起/軸索の分岐、軸索の形状、シナプス結合、細胞体の位置などのニューロンの形状と構造は、ニューロンタイプの分類に使用されます。急性スライス標本または生体内では、層状位置も重要な機能的影響があるため注目されます。ビオチンによる染色は、ニューロンの電気生理学的記録中に行われます。^{[ 30 ]}あるいは、細胞外にローダミンを加えることで、記録前に生細胞をイメージすることができます。 ^{[ 31 ]} イメージングは​​、明視野透過チャネルと蛍光チャネルによる個々の細胞の2次元タイル画像によって行われ、その後、市販またはオープンソースのソフトウェアで処理されます。^{[ 14 ]} 培養ニューロンからは、急性スライスと比較して高解像度の画像が得られ、より高品質の形態学的再構築が得られます。^{[ 10 ]}

事後3D再構成は、TReMAP ^{[ 32 ]} Mozak ^{[ 33 ]}または Vaa3D ^{[ 34 ]}などの画像処理ソフトウェアによって行われます。結果の品質は、電気生理学的記録時間から核抽出手順まで、さまざまな要因に依存します。再構成された細胞は、構造の完全性と完全性に応じて、4つの品質レベルに分類されます。細胞体と突起が完全に視認でき、適切なデジタル再構成が可能な場合は高品質、細胞体と一部の突起は視認できるが3D再構成には適さない場合は中品質、樹状突起はビオチンで満たされているが軸索は弱く染色されている場合は不十分な軸索、核抽出後の構造の沈降により細胞体の染色が欠如している場合は不十分な充填となります。 ^{[ 14 ]}

これまでのところ、使用されている唯一のシーケンス技術はmRNAシーケンスです。他のモダリティも含めることで、生成されるデータに含まれる「オミクス」の数を増やすことができます。たとえば、mRNAをDNAから分離する技術により、DNAの修飾を研究することができます。^{[ 23 ]} クロマチンアクセシビリティは、 DNAメチル化とメチル化DNA免疫沈降、およびChIPシーケンスからのヒストンアセチル化と脱アセチル化を使用して判断できます。これにより、パッチシーケンス実験でエピジェネティクスを研究することができます。同様に、タンパク質を分離することは、タンパク質の存在量を判断するのに役立ち、プロテオミクスとの統合を可能にします。CRISPRをピペットに含めて記録中に注入することで、単一細胞レベルでの変異の影響を調べることができます。^{[ 10 ]}

パッチシーケンスのスループットにおける最大のボトルネックは、パッチクランプに必要な労力です。自動化されたパッチクランプは徐々に標準になりつつありますが、まだ広く普及していません。これは、一部の自動パスリグが人間よりも高いシール試行成功率とデータ収集率を示しているにもかかわらずです。自動パッチクランプは、画像情報なしで盲目的に行うこともできます。代わりに、圧力センサーに頼ってアルゴリズムに入力し、ロボットリグを誘導してシールを形成し、記録します。あるいは、蛍光標識された細胞をターゲットにできる画像誘導アルゴリズムも存在します。一部のシステムは、特定のモデルシステムや準備により適しています。^{[ 43 ]}