自動パッチクランプ

自動パッチクランプ法は、個々の細胞の電気的活動を測定する方法として、手動パッチクランプ法に取って代わり始めています^{[1] 。}細胞培養および生体内の細胞からのパッチクランプ記録を自動化するために、さまざまな技術が使用されています。この作業は、手動パッチクランプの複雑さとコストを削減しようとする研究室や企業によって1990年代後半から続けられています。パッチクランプ法は長い間芸術形式であると考えられており、特に生体内では依然として非常に時間がかかり、退屈です。自動化技術は、単一細胞から高品質の電気生理学的記録を取得する際のユーザーエラーと変動性を削減しようとします。

ガラスピペットを使用した従来の手動パッチクランプ法は、エルヴィン・ネーハーとバート・ザックマンによって開発され、高度な技術を持った技術者を必要としました。技術者はガラスピペットを細胞の近くに置き、適切な吸引力を加えてピペットと細胞膜の間に電気シールを作ります。このシールは、ピペットの先端と細胞膜の間から電流が漏れるのを防ぎ、高品質の記録を保証します。このシールは、細胞の膜がピペットの先端と化学的に結合し、ピペットの内側が細胞の細胞質にのみ接続されるときに作られます。この膜とガラスの接続またはシールは「ギガシール」と呼ばれます。^[2]

技術者は伝統的に口を使って、細胞に密封するために必要な正確な圧力を加えていました。圧力を制御することに加えて、技術者は膜がピペットで密封されるように、細胞から正確な距離にピペットを配置する必要もあります。マイクロマニピュレーターを使用して、技術者がピペット内の液体と周囲の液体との間の電気抵抗の変化を確認するまで、ピペットを細胞に向かって移動させます (アニメーションを参照)。技術者が細胞から確実に記録できるようになるまで、通常、これには 3 ～ 12 か月のトレーニングが必要です。技術者は基本的に、複数のシステム (動き、圧力、電気信号) を同時に監視および操作するというバランスをとる行為を行っています。プロセスの各部分を正確に適切なタイミングで実行しないと、密封が適切に形成されず、技術者はピペットを交換して最初からやり直す必要があります。

これらの課題により、技術者が取得できる記録の数が減り、コストが大幅に増加します。自動化は、手動パッチクランプの時間、複雑さ、コストを削減することを目指しています。スループットの向上は、他のシーケンシング方法に匹敵する規模でニューロンの電気生理学、形態学、トランスクリプトーム特性を同時に組み合わせる高スループットパッチシークエンスを可能にするための鍵でもあります^[3]

自動化技術は、細胞の周囲の環境に応じて異なります。生体内の細胞の場合、これは通常、細胞が脳内にあり、他の細胞に囲まれていることを意味します。この環境には、血管、樹状突起、軸索、グリア細胞も含まれており、直径 1～2μm のピペット チップが詰まってギガシールの形成が困難になります。ここで、ピペット チップでの圧力と位置の正確な制御は、詰まりを防ぎ、上で説明したように、細胞がピペットの先端近くにあるかどうかを検出する上で大きな役割を果たします。

体外の細胞は、液体に浮遊させたり、培養皿に付着させたり、動物から取り除いた組織の一部のままにしたりすることができます。これらの環境では通常、動物の心拍や呼吸による組織の動きを補正する必要はありません。浮遊細胞の場合、ピペットは完全にマイクロチップに置き換えられ、穴があいていてギガシールを作成し、電気活動を測定できます。培養皿内の細胞や組織は、細胞とピペットを顕微鏡で見ることができるため、目詰まりもそれほど問題になりません。技術者は、目的の細胞以外のものを避けることができます。

これらの自動化システムはそれぞれ、いくつかのタスクを実行する必要があります。ピペットの先端、または 1 ～ 2 μm の穴がある他のデバイスの横にセルを配置し、穴の圧力を制御し、セル内の電圧を制御する必要があります。

生体内パッチクランプ法の一例が、Kodandaramaiahらによって示されました。^[4]この場合、圧力制御は、技術者が以前に提供していた3つの圧力（高圧800〜1000mbar、低圧20〜30mbar、小さな真空15〜150mbar）を提供するための電子バルブと電子圧力レギュレータのセットで構成されていました。3つの電子バルブが3つの圧力と大気圧を切り替えました。高圧はピペットの詰まりを防ぐために使用され、低圧は細胞を探すときに使用され、真空はギガシーリングプロセスを助けるために使用されました。これらはすべてコンピューターによって制御され、ピペットの先端の抵抗が変化すると圧力が選択されました。

この場合、手動の位置制御は、ピペットを 2 ～ 3 μm ずつ組織内に移動させて細胞に接触させるコンピューター制御の圧電 マイクロマニピュレーターに置き換えられました。この精密制御は、手動による位置決めよりもはるかに正確で再現性が高く、オペレーターを必要としません。

コンピューターは、ピペットが細胞に接触するときの電気抵抗の変化も計算して追跡します。電圧信号は矩形波の形でピペットに送られ、ピペットの端から出るか、細胞膜によってブロックされます。細胞膜によってブロックされると、コンピューターはピペットの動きを止め、吸引力を加えてギガシールを形成します。この自動化により、技術者が行う必要があった意思決定がなくなり、技術者とは異なり、コンピューターはこれらの作業を疲れることなく、より正確に実行できます。

これらの手順はすべて、手動パッチクランプと同じ論理的な順序で実行されますが、実行するために大規模なトレーニングは必要なく、コンピューターによって完全に制御されます。これにより、パッチクランプ記録を取得するために必要な費用が削減され、生体脳での記録の再現性と堅牢性が向上します。

懸濁培養中の細胞をパッチクランプするための多くのタイプのシステムが開発されています。1 つのシステムでは、従来のピペットと液滴懸濁培養中の細胞を使用してパッチクランプ記録を取得します (図を参照)。このシステムには、従来のピペット製造システムを使用してガラス毛細管を加熱し、縦方向に引っ張ってパッチクランプで使用する先細りの先端を作成するという利点もあります。

より一般的な浮遊培養の自動化システムでは、ピペットの代わりに平面基板に小さな（1-2μm）穴が開いたマイクロチップを使用してギガシールを作成し、単一細胞から記録します。パッチチップは、半導体業界で開発された微細加工技術の向上の結果として、2000年代初頭に開発されました。チップは通常、シリコン、ガラス、PDMS、ポリイミドで作られています。パッチチップシステムは通常、より複雑で高価ですが、並列操作とハンズフリー操作という利点があります。^{[5] [6] [7]}

通常、ニューロンは浮遊培養では成長しませんが、他の細胞タイプは成長できます。一部の細胞は、遺伝子を導入して目的の膜イオンチャネルを作成できます。つまり、通常は電気活動をしない細胞でも、膜内にイオンチャネルを成長させてイオン電流を生成できます。浮遊培養では細胞が互いに分離しているため、単一細胞のイオン電流を正確に測定できます。これにより、研究者は、ニューラルネットワークで通常発生する他の細胞からの電流の干渉なしに、より制御された環境でイオンチャネルの挙動を研究できます。これは、特定のタンパク質をターゲットとする薬物スクリーニング研究で特に役立ちます。^[8] 浮遊細胞の取り扱いは培養細胞や生体内の細胞の取り扱いよりもはるかに簡単なので、パッチクランプ記録をこの方法ではるかに迅速かつ確実に取得できます。これにより生産性が向上し、何千もの化合物のスクリーニングが可能になります。^[9]

接着培養された幹細胞由来のニューロンは懸濁液中に採取することができ、平面パッチクランプ装置での使用に成功している。^[10]電位依存性ナトリウムチャネル、電位依存性カリウムチャネル、リガンドGABAによって開口したイオンチャネルなどのイオンチャネルは、自動および手動パッチクランプを使用してこれらの細胞から記録された。^[11]

培養細胞や脳組織の切片を自動パッチクランプする in vitro 法は数多くあります。

1つは、上で説明したようなパッチチップと、培養細胞が成長するにつれてギガシールが形成される開口部に移動するようにする表面処理を使用する方法です。^[12] ニューロンを培養で成長させることで、脳内のネットワークのように、懸濁液中の孤立した細胞よりも自然組織に近いネットワークを自発的に形成します。

別の方法では、細胞を動物から取り出し、パッチチップ上で2～4時間培養すると、細胞がポリイミドやPDMSパッチチップと自発的にギガシールを形成します^[13] このシステムでは、ギガシールを形成するために外部機器は必要ありません。

もう一つの技術は、培養中のパッチクランプ細胞の位置決めを自動化する。精密な圧電駆動ステージ上のナノピペットを使用して、培養皿内の表面をスキャンする。スキャン中、ピペットを上下に動かすことで、ピペットの先端とその下の表面または細胞との間の電気容量を一定に保つ。（細胞に近づくと容量が増加するため、アクチュエータはピペットを遠ざけ、逆もまた同様である。）これにより、培養皿内の表面の正確な地形図が得られる。細胞がマッピングされた後、コンピューターはピペットを選択した細胞まで移動させ、下げてギガシールを形成する。^[14]

もう 1 つの技術は、細胞と慎重に接触する作業を自動化するだけです。オペレーターはサンプルの上にピペットを置き、自動化されたソフトウェアに任せてピペットを下げ、細胞と接触したときにピペットの抵抗が増加するかどうかを検出します。この時点でプロセスは終了し、技術者がギガシールを手作業で作成します。

パッチクランプ自動化機器は2003年に市販されました。当初のコストが高かったため、この20年近く前の技術はもともとバイオテクノロジーや製薬業界向けに提供されることが意図されていましたが、その後、他の関連または補完的な技術や方法と連携して、学術界や非営利団体でも使用されるようになりました。^[15]自動化パッチクランプ電気生理学の受容と認識は、この技術を使用して出版された科学文献の増加に反映されています^[16]

• 平面パッチクランプに関する本の章 2010-03-31 にWayback Machineでアーカイブされました