電圧感受性染料

電位感受性染料は電位差測定染料とも呼ばれ、電圧の変化に応じてスペクトル特性が変化する染料です。 ^[1]単一ニューロン、大規模なニューロン集団、または心筋細胞の発火活動を線形測定できます。多くの生理学的プロセスは細胞膜電位の変化を伴い、これは電位感受性染料で検出できます。測定値は活動電位の発生場所を示し、活動電位の速度と方向の測定値を得ることができます。^[2]

電位差測定色素は、ミトコンドリアや樹状突起棘など、電極を挿入できない細胞小器官内の電気的活動をモニターするために使用されます。この技術は、複雑な多細胞標本における活動パターンの研究に特に有効です。また、単一細胞の表面に沿った 膜電位の空間的および時間的変化を測定することも可能になります。

高速応答プローブ: これらは両親媒性の膜染色染料で、通常は膜アンカーとして機能する炭化水素鎖のペアと、膜/水性界面に対して垂直に発色団を整列させる親水基を持っています。発色団は、基底状態から励起状態への励起の結果として大きな電子電荷シフトを起こすと考えられており、これがこれらの染料の膜電位に対する感度の推定エレクトロクロミック機構の基礎となっています。この分子 (染料) は、生体膜の親油性部分に挿入されます。この配向により、励起によって誘発される電荷​​再分配が膜内の電界と平行に発生します。したがって、膜全体の電圧が変化すると、電界と基底状態および励起状態の双極子モーメントとの直接的な相互作用から生じるスペクトル シフトが発生します。

新しい電圧染料は、共役分子ワイヤを介した光誘起電子移動（PeT）を利用して、高速かつ高感度に電圧を感知することができます。^{[3] [4]}

低速応答プローブ: これらは、膜貫通分布において電位依存的な変化を示し、蛍光変化を伴います。一般的な低速応答プローブには、カチオン性カルボシアニン、ローダミン、イオン性オキソノールなどがあります。

一般的に使用されている電圧感受性色素は、ジ-4-ANEPPS、ジ-8-ANEPPS、RH237などの置換アミノナフチルエテニルピリジニウム（ANEP）色素です。物理的特性を変える化学修飾に応じて、さまざまな実験手順に使用されます。^[5]これらは、1985年にLeslie Loewの研究グループによって初めて説明されました。^[6] ANNINE-6plusは、応答が速く（応答時間がns）、感度が高い電圧感受性色素です。Guixue Buらは、心筋細胞の単一のT管の活動電位を測定するためにこれを適用しました。 ^[7] 最近では、感度と光安定性が向上した一連のフッ素化ANEP色素が導入されました。これらは、幅広い励起波長と発光波長で利用できます。^[8] 最近の計算研究により、ANEP色素は静電環境のみの影響を受け、特定の分子相互作用の影響を受けないことが確認されました。^{[9]キサンテン[10]}などの他の構造足場も効果的に使用されています。

電位感受性染料を用いた脳活動の画像化の核となる材料は染料そのものである。これらの電位感受性染料は親油性であり、疎水性の末端で膜内に局在することが好ましい。これらは蛍光や吸収を伴う用途に使用され、即効性があり、膜電位の変化を線形に測定することができる。^{[11]電位感受性染料は、生物学的用途の}蛍光プローブを提供する多くの企業によって供給されている。Potentiometric Probes, LLC は電位感受性染料のみを専門としており、ElectroFluor ブランドで販売されているフッ素化 VSD の大規模なセットを販売する独占ライセンスを保有している。

染料と組み合わせて様々な特殊な機器が使用される可能性があり、機器の選択は調製物の特殊性に応じて異なります。基本的に、機器には特殊な顕微鏡や画像装置が含まれ、技術的なランプやレーザーが含まれる場合もあります。^[11]

電圧感受性染料を使用して脳活動を画像化する利点には、次のものがあります。

• 多くの領域からの集団信号を同時に測定し、数百のニューロンを記録することができます。このような多部位記録は、活動電位の開始と伝播（方向と速度を含む）およびニューロンの分岐構造全体に関する正確な情報を提供します。^[11]
• 行動を生み出している神経節のスパイク活動を測定することで、その行動がどのように生み出されているかに関する情報が得られる可能性がある。^[11]
• 特定の調製法では、染色ピペットを取り除き、ニューロンを1～2時間回復させることで、染料の薬理学的効果が完全に逆転する可能性があります。^[11]
• 末端樹状突起におけるシグナル統合を解析するために染料が使用されることがある。電圧感受性染料は、これを実行するための遺伝子コード化された電圧感受性タンパク質（Ci-VSP由来タンパク質など）の唯一の代替手段である。^[11]
• ElectroFluor-530sやdi-2-ANEPEQなどのより溶解性の高い染料は、パッチピペットを介して単一細胞に内部灌流することができます。この技術により、脳スライス内の個々の樹状突起^{[12] [13]}と樹状突起棘^{[14] [15] [16] [17]}の電気信号を研究することが可能になりました。

電圧感受性染料を用いた脳活動の画像化の弱点には、以下の問題が含まれます。

• 電圧感受性色素は、調製物ごとに非常に異なる反応を示す可能性があり、通常、最適な信号を得るためには数十種類の色素をテストする必要があります。^[11]励起波長、発光波長、露光時間などのイメージングパラメータも最適化する必要があります。
• 電圧感受性染料は結合組織を透過できなかったり、細胞内空間を通過して研究対象となる膜領域まで移動できなかったりすることが多い。^{[11]これらの染料を使用する場合、染色は深刻な問題となる。ANNINE} -6plus 、ElectroFluor-530s、di-2-ANEPEQなどの水溶性染料では、この問題は発生しない。
• 一方、染料が水溶性すぎると、染色が持続しない場合があります。この問題は、より長いアルキル鎖を含む染料を使用して親油性を高めることで解決できます。
• ノイズは電圧感受性色素を用いたすべての標本で問題となり、特定の標本では信号が著しく不明瞭になることがあります。^[11]信号対ノイズ比は空間フィルタリングまたは時間フィルタリングアルゴリズムで改善できます。このようなアルゴリズムは多数存在し、ANNINE-6plus色素を用いた最近の研究で1つの信号処理アルゴリズムが見つかります。^[7]
• 細胞は治療によって永久的に影響を受ける可能性がある。持続的な薬理学的効果の可能性があり、染料の光力学は損傷を与える可能性がある。^[11]最近開発されたフッ素化電圧感受性染料は、これらの影響を軽減することが示されている。^{[8] [18]}

電圧感受性染料は、イカの巨大軸索、^[19] ラットの体性感覚皮質のヒゲ樽、 ^{[20] [21]サンショウウオの} 嗅球、^{[22] [23] [24]ネコの視覚} 皮質、 ^[25 ]カエルの視蓋、[ ²⁶ ]アカゲザルの視覚皮質など、さまざまな生物の神経系のいくつかの領域における神経活動を測定するために使用されてきました。^{[27] [28]}

心臓電気生理学における多くの応用が発表されており、様々な動物種の心臓全体の電気活動のex vivoマッピング^{[29]、[30]、}単一心筋細胞の細胞内イメージング^{[31] 、さらには}生体内のブタの開心術における洞調律と不整脈の両方のマッピング^[18]などがあり、電圧感受性色素蛍光の二重波長比イメージングによって動きのアーティファクトを排除することができました。